一、摘要

禾谷類作物外源基因?qū)肱c表達的研究現(xiàn)狀及進展。詳細闡述了常用的外源基因?qū)敕椒ǎㄞr(nóng)桿菌介導法、基因槍法等，以及影響外源基因在禾谷類作物中表達的多種因素，如啟動子選擇、基因沉默現(xiàn)象等。此外，對目前研究成果在提高作物產(chǎn)量、增強抗逆性等方面的應用進行了討論，并對未來研究方向提出展望，旨在為禾谷類作物基因工程改良提供全面而深入的參考。

二、引言

禾谷類作物是全球重要的糧食作物，為人類提供了大量的碳水化合物、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)。隨著人口增長和環(huán)境變化，提高禾谷類作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性成為保障全球糧食安全的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的育種方法在一定程度上滿足了人類對禾谷類作物改良的需求，但存在周期長、遺傳資源有限等局限性?；蚬こ碳夹g(shù)的出現(xiàn)為禾谷類作物的改良提供了新的途徑，通過將外源基因?qū)牒坦阮愖魑铮梢再x予其新的優(yōu)良性狀，如抗病蟲害、抗逆、提高營養(yǎng)價值等。因此，深入研究禾谷類作物外源基因?qū)肱c表達對于推動農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有至關(guān)重要的意義。

三、外源基因?qū)牒坦阮愖魑锏姆椒?/p>

（一）農(nóng)桿菌介導法

原理

農(nóng)桿菌是一種天然的基因工程載體，其中根癌農(nóng)桿菌含有 Ti 質(zhì)粒，發(fā)根農(nóng)桿菌含有 Ri 質(zhì)粒。當農(nóng)桿菌感染植物傷口時，Ti 或 Ri 質(zhì)粒上的 T - DNA 區(qū)可以轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中。在基因工程應用中，將目的基因插入到經(jīng)過改造的 T - DNA 區(qū)域，通過農(nóng)桿菌與禾谷類作物組織的共培養(yǎng)，實現(xiàn)外源基因的導入。

實驗步驟

農(nóng)桿菌菌株的選擇與培養(yǎng)：選擇適合禾谷類作物轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株，如 LBA4404 等。將農(nóng)桿菌接種于含有相應抗生素的 LB 液體培養(yǎng)基中，在 28℃、200rpm 的條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

禾谷類作物外植體的準備：選取合適的禾谷類作物組織作為外植體，如水稻的幼胚、玉米的幼穗等。將外植體消毒后，在無菌條件下切成適當大小。

共培養(yǎng)：將處于對數(shù)生長期的農(nóng)桿菌菌液與外植體在共培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)基中通常含有特定的植物激素和乙酰丁香酮等誘導物質(zhì)。共培養(yǎng)條件一般為 22 - 25℃、黑暗環(huán)境下培養(yǎng) 2 - 3 天。

篩選與再生：共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)移至含有篩選抗生素的再生培養(yǎng)基上，抑制未轉(zhuǎn)化細胞的生長，促進轉(zhuǎn)化細胞的再生。經(jīng)過多次篩選和繼代培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

（二）基因槍法

原理

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用高速飛行的金屬微粒（如金粉或鎢粉）將外源 DNA 帶入植物細胞。這些金屬微粒表面吸附有目的基因，在高壓氣體或爆炸等動力作用下，微粒高速穿透植物細胞壁和細胞膜，將外源基因?qū)爰毎麅?nèi)。

實驗步驟

微彈制備：將金粉或鎢粉與外源 DNA、氯化鈣、亞精胺等混合，使 DNA 吸附在微彈表面。經(jīng)過離心、洗滌等步驟，制備成可用于轟擊的微彈。

植物材料準備：選擇禾谷類作物的幼嫩組織或細胞懸浮培養(yǎng)物作為轟擊對象。將植物材料置于培養(yǎng)皿中，固定在基因槍的轟擊室內(nèi)。

轟擊參數(shù)設(shè)置：根據(jù)不同的基因槍類型和植物材料，設(shè)置合適的轟擊壓力、距離和次數(shù)等參數(shù)。例如，對于水稻幼胚，轟擊壓力可設(shè)置為 1100 - 1300psi，轟擊距離為 6 - 9cm，轟擊次數(shù)為 1 - 2 次。

轟擊后處理：轟擊完成后，將植物材料轉(zhuǎn)移至合適的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)和篩選，方法類似于農(nóng)桿菌介導法中的再生和篩選步驟。

（三）其他方法

花粉管通道法

在授粉后一定時間內(nèi)，將含有外源基因的溶液注射到花柱內(nèi)，使外源基因隨著花粉管的伸長進入胚囊，從而實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化。這種方法操作相對簡單，但轉(zhuǎn)化效率較低且可重復性較差。

電穿孔法

利用高壓電脈沖在植物細胞膜上形成短暫的可逆性小孔，使外源 DNA 能夠通過這些小孔進入細胞。該方法需要特定的電穿孔設(shè)備，并且對細胞的損傷和處理條件要求較為嚴格。

四、影響外源基因在禾谷類作物中表達的因素

（一）啟動子的選擇

啟動子是調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵元件。在禾谷類作物基因工程中，常用的啟動子包括組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導型啟動子。

組成型啟動子

如 CaMV35S 啟動子，它可以在植物的各個組織和發(fā)育階段持續(xù)驅(qū)動基因表達。但在某些情況下，組成型表達可能會導致植物生長發(fā)育異?；蚰芰坷速M。

組織特異性啟動子

例如，水稻谷蛋白基因啟動子可以在水稻種子中特異性啟動基因表達，將目的基因在特定組織中表達可以更有效地發(fā)揮其功能，同時減少對其他組織的不良影響。

誘導型啟動子

如受干旱、高溫等環(huán)境因素誘導的啟動子，當植物受到相應脅迫時，啟動子被激活，使目的基因表達，增強植物的抗逆性。

（二）基因沉默現(xiàn)象

基因沉默是外源基因在植物中表達過程中常見的問題，主要包括轉(zhuǎn)錄水平基因沉默和轉(zhuǎn)錄后基因沉默。

轉(zhuǎn)錄水平基因沉默

主要是由于 DNA 甲基化、異染色質(zhì)化等原因，導致基因轉(zhuǎn)錄受到抑制。例如，當外源基因插入到基因組中的某些甲基化敏感區(qū)域時，可能會發(fā)生高度甲基化，從而使基因無法正常轉(zhuǎn)錄。

轉(zhuǎn)錄后基因沉默

與小 RNA 介導的 RNA 降解機制有關(guān)。當外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 mRNA 與細胞內(nèi)的小 RNA 互補配對時，mRNA 會被降解，導致基因表達量降低或無法表達。

（三）拷貝數(shù)與整合位點

外源基因在禾谷類作物基因組中的拷貝數(shù)和整合位點對其表達有顯著影響。高拷貝數(shù)的外源基因可能會引起基因沉默，而整合到轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域的外源基因通常比整合到沉默區(qū)域的基因表達效率更高。

五、外源基因?qū)肱c表達在禾谷類作物改良中的應用

（一）提高作物產(chǎn)量

通過導入與光合作用、養(yǎng)分吸收和利用等相關(guān)的外源基因，可以提高禾谷類作物的產(chǎn)量。例如，將編碼高效光合作用相關(guān)酶的基因?qū)胨局?，增強水稻的光合效率，從而增加產(chǎn)量。

（二）增強抗逆性

抗病蟲害

導入抗蟲基因（如 Bt 基因）或抗病基因，可以使禾谷類作物對害蟲和病原菌具有更強的抵抗力。例如，轉(zhuǎn) Bt 基因的玉米能夠有效抵抗玉米螟的侵害。

抗非生物脅迫

引入抗逆相關(guān)基因，如抗干旱、抗鹽堿基因等。如將來自于某些耐鹽植物的基因?qū)胄←溨?，提高小麥的耐鹽性，使其能夠在鹽堿地等惡劣環(huán)境下生長。

（三）改善作物品質(zhì)

營養(yǎng)品質(zhì)

可以通過導入編碼特定營養(yǎng)成分（如維生素、礦物質(zhì)、必需氨基酸等）合成相關(guān)的基因，改善禾谷類作物的營養(yǎng)品質(zhì)。例如，通過基因工程提高水稻中維生素 A 前體的含量，有助于緩解維生素 A 缺乏問題。

加工品質(zhì)

改變禾谷類作物的淀粉、蛋白質(zhì)等成分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以滿足不同的加工需求。如改變小麥面筋蛋白的組成，提高面粉的加工品質(zhì)。

六、研究進展與挑戰(zhàn)

（一）研究進展

近年來，禾谷類作物外源基因?qū)肱c表達研究取得了顯著成果。在轉(zhuǎn)化方法上，農(nóng)桿菌介導法和基因槍法不斷優(yōu)化，轉(zhuǎn)化效率有所提高，并且新的轉(zhuǎn)化方法也在不斷探索。在基因表達調(diào)控方面，對啟動子的研究更加深入，能夠更精準地控制外源基因的表達。同時，通過多基因轉(zhuǎn)化等技術(shù)，實現(xiàn)了對禾谷類作物多個性狀的同時改良。

（二）挑戰(zhàn)

盡管取得了進展，但仍面臨一些挑戰(zhàn)。首先，基因沉默問題仍然是影響外源基因穩(wěn)定表達的重要因素，需要進一步深入研究其機制并尋找有效的解決方法。其次，對于外源基因?qū)肟赡軒淼沫h(huán)境和食品安全問題需要進行更全面的評估。此外，提高轉(zhuǎn)化效率、降低成本以及拓展可轉(zhuǎn)化的禾谷類作物品種范圍等也是未來研究需要解決的問題。

七、結(jié)論與展望

禾谷類作物外源基因?qū)肱c表達研究為作物改良提供了強大的工具和廣闊的前景。通過不斷優(yōu)化導入方法、深入研究基因表達調(diào)控機制以及解決相關(guān)的挑戰(zhàn)，可以更有效地利用基因工程技術(shù)提高禾谷類作物的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性。未來的研究需要跨學科的合作，綜合考慮科學、環(huán)境和社會等多方面因素，以實現(xiàn)禾谷類作物基因工程改良的可持續(xù)發(fā)展，為保障全球糧食安全做出更大的貢獻。同時，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，如基因編輯技術(shù)的興起，有望與外源基因?qū)爰夹g(shù)相結(jié)合，開創(chuàng)禾谷類作物改良的新局面。