摘要：本研究聚焦于蟬抗菌肽 Cryptonin 在畢赤酵母中的表達與鑒定。通過基因克隆技術獲取 Cryptonin 基因，構建重組表達載體并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中。優(yōu)化培養(yǎng)條件以提高表達量，利用多種蛋白純化和鑒定方法，包括親和層析、高效液相色譜、質(zhì)譜分析及抗菌活性檢測等，對表達產(chǎn)物進行全面分析。結果成功實現(xiàn)了 Cryptonin 在畢赤酵母中的高效表達，并證實了表達產(chǎn)物具有預期的抗菌活性，為 Cryptonin 的大規(guī)模生產(chǎn)和進一步的醫(yī)藥應用研究提供了有力支持。

一、引言

抗菌肽作為生物免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，具有廣譜抗菌活性、作用機制更好且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，成為近年來醫(yī)藥領域的研究熱點。蟬抗菌肽 Cryptonin 是其中一種具有潛力的抗菌肽，在天然防御病原體入侵方面發(fā)揮關鍵作用。研究其在畢赤酵母中的表達與鑒定，對于開發(fā)新型抗菌藥物具有重要意義。

畢赤酵母表達系統(tǒng)以其能夠高效表達外源蛋白、易于基因操作、可對表達產(chǎn)物進行翻譯后修飾等優(yōu)勢，被廣泛應用于重組蛋白的生產(chǎn)。將 Cryptonin 在畢赤酵母中進行表達，有望實現(xiàn)其大規(guī)模生產(chǎn)，滿足醫(yī)藥研發(fā)對大量高純度抗菌肽的需求。本研究旨在建立穩(wěn)定、高效的 Cryptonin 在畢赤酵母中的表達體系，并對表達產(chǎn)物進行準確鑒定，為后續(xù)的應用研究奠定基礎。

二、材料與方法

（一）材料

菌株和載體
蟬來源的 Cryptonin 基因模板、畢赤酵母菌株 GS115、表達載體 pPICZαA。

試劑
限制性內(nèi)切酶（如 EcoR I、Xba I）、T4 DNA 連接酶、DNA 聚合酶、瓊脂糖、酵母提取物、蛋白胨、山梨醇、甲醇、各種抗生素、鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱、高效液相色譜（HPLC）分析所需的流動相試劑、用于質(zhì)譜分析的基質(zhì)等。

（二）方法

Cryptonin 基因的克隆
從蟬組織中提取總 RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄 - 聚合酶鏈反應（RT - PCR）獲得 Cryptonin 的 cDNA。設計特異性引物，在引物兩端引入合適的限制性內(nèi)切酶位點（如 EcoR I 和 Xba I），以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增，得到帶有酶切位點的 Cryptonin 基因片段。PCR 反應條件經(jīng)過優(yōu)化，包括退火溫度、延伸時間等參數(shù)，確保擴增產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量。

重組表達載體的構建
將擴增得到的 Cryptonin 基因片段和表達載體 pPICZαA 分別用 EcoR I 和 Xba I 進行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒回收目的基因片段和線性化的載體。然后，在 T4 DNA 連接酶的作用下，將 Cryptonin 基因片段與線性化載體在 16℃下連接過夜，構建重組表達載體 pPICZαA - Cryptonin。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細胞中，通過含有 Zeocin 的 LB 平板篩選陽性克隆。挑取陽性克隆進行菌落 PCR 和測序驗證，確保重組載體中 Cryptonin 基因序列的正確性。

畢赤酵母的轉(zhuǎn)化
將構建好的重組表達載體 pPICZαA - Cryptonin 用 Sac I 線性化，然后通過電轉(zhuǎn)化的方法將線性化的重組載體導入畢赤酵母 GS115 感受態(tài)細胞中。電轉(zhuǎn)化參數(shù)經(jīng)過優(yōu)化，包括電壓、電容和電阻等，以提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化后的細胞涂布在含有 Zeocin 的 YPDS 平板上，在 30℃下培養(yǎng) 2 - 3 天，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。

重組畢赤酵母的篩選與鑒定
對篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子進行菌落 PCR 鑒定，使用載體上的通用引物和 Cryptonin 基因特異性引物，驗證 Cryptonin 基因是否成功整合到畢赤酵母基因組中。同時，提取陽性轉(zhuǎn)化子的基因組 DNA，通過 Southern blotting 進一步確認基因整合情況，確定單拷貝和多拷貝整合的轉(zhuǎn)化子。

重組畢赤酵母的培養(yǎng)與誘導表達
將篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子接種至含有一定濃度 Zeocin 的 BMGY 培養(yǎng)基中，在 30℃、250rpm 的條件下培養(yǎng)至 OD???約為 2 - 6。然后，離心收集細胞，用 BMMY 培養(yǎng)基重懸，并添加甲醇至終濃度為 0.5% - 1.0% 進行誘導表達。誘導過程在 30℃下持續(xù)進行，每隔 24 小時添加一次甲醇以維持誘導狀態(tài)。同時，設置不同的誘導時間（24、48、72、96 小時等）和甲醇濃度梯度（0.5%、0.75%、1.0%、1.25% 等），通過 SDS - PAGE 分析蛋白表達情況，優(yōu)化表達條件，以獲得最高的 Cryptonin 表達量。

表達產(chǎn)物的純化
誘導表達結束后，離心收集培養(yǎng)液，通過鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱對表達產(chǎn)物進行初步純化。將培養(yǎng)液上樣至平衡好的親和層析柱，用含有低濃度咪唑（如 20 - 50mM）的緩沖液進行洗滌，去除非特異性結合的蛋白，然后用含有高濃度咪唑（如 200 - 500mM）的緩沖液進行洗脫，收集含有 Cryptonin 的洗脫峰。對初步純化的產(chǎn)物進一步采用高效液相色譜（HPLC）進行精細純化，選擇合適的色譜柱和流動相條件，根據(jù)蛋白的保留時間收集目標峰。

表達產(chǎn)物的鑒定

質(zhì)譜分析：對純化后的蛋白樣品進行質(zhì)譜分析，包括基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI - TOF - MS）和電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI - MS），測定蛋白的分子量，并與理論分子量進行對比，確定表達產(chǎn)物是否為目標蛋白 Cryptonin。

N - 末端氨基酸序列測定：采用 Edman 降解法測定純化后蛋白的 N - 末端氨基酸序列，與已知的 Cryptonin 氨基酸序列進行比對，進一步驗證蛋白的正確性。

抗菌活性檢測：采用瓊脂擴散法和液體稀釋法檢測純化后的 Cryptonin 對多種常見病原菌（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等）的抗菌活性。在瓊脂擴散法中，將病原菌均勻涂布在瓊脂平板上，在平板上打孔，加入不同濃度的 Cryptonin 溶液，培養(yǎng)后觀察抑菌圈大小。在液體稀釋法中，將 Cryptonin 溶液與病原菌菌液混合，在一定溫度下培養(yǎng)一定時間后，通過測定菌液的吸光度或平板計數(shù)法確定低抑菌濃度（MIC）和低殺菌濃度（MBC）。

三、結果

（一）Cryptonin 基因的克隆與重組表達載體的構建

通過 RT - PCR 成功擴增出 Cryptonin 基因片段，大小與預期相符。構建的重組表達載體 pPICZαA - Cryptonin 經(jīng)菌落 PCR 和測序驗證，表明 Cryptonin 基因已正確插入到載體中，且序列無突變。

（二）畢赤酵母的轉(zhuǎn)化與陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

電轉(zhuǎn)化后，在含有 Zeocin 的 YPDS 平板上篩選出多個陽性轉(zhuǎn)化子。菌落 PCR 和 Southern blotting 結果顯示，部分轉(zhuǎn)化子中 Cryptonin 基因成功整合到畢赤酵母基因組中，其中包括單拷貝和多拷貝整合的轉(zhuǎn)化子。

（三）重組畢赤酵母的培養(yǎng)與誘導表達優(yōu)化

通過優(yōu)化誘導時間和甲醇濃度，SDS - PAGE 結果顯示，在誘導 72 小時、甲醇濃度為 1.0% 時，Cryptonin 的表達量最高。表達的蛋白在分子量大小上與理論值相符，主要以可溶形式存在于培養(yǎng)液中。

（四）表達產(chǎn)物的純化

經(jīng)過鎳瓊脂糖凝膠親和層析和 HPLC 純化后，獲得了純度較高的 Cryptonin 蛋白，SDS - PAGE 顯示單一清晰的條帶。

（五）表達產(chǎn)物的鑒定

質(zhì)譜分析：MALDI - TOF - MS 和 ESI - MS 結果表明，純化后的蛋白分子量與理論分子量基本一致，誤差在允許范圍內(nèi)，證實為 Cryptonin。

N - 末端氨基酸序列測定：Edman 降解法測得的 N - 末端氨基酸序列與已知的 Cryptonin 序列匹配，進一步確認了蛋白的身份。

抗菌活性檢測：瓊脂擴散法和液體稀釋法結果顯示，表達的 Cryptonin 對測試的多種病原菌具有顯著的抗菌活性，其 MIC 和 MBC 值在一定范圍內(nèi)，表明具有良好的抗菌效果。

四、討論

（一）基因克隆與載體構建的要點

在 Cryptonin 基因克隆過程中，引物設計至關重要，合適的限制性內(nèi)切酶位點選擇確保了基因與載體的正確連接。同時，PCR 反應條件的優(yōu)化對于獲得高質(zhì)量、特異性的基因片段起到關鍵作用。在重組表達載體構建時，連接反應的條件如溫度和時間需要精確控制，以提高連接效率和減少載體自連。

（二）畢赤酵母轉(zhuǎn)化與篩選的問題

電轉(zhuǎn)化過程中，參數(shù)的優(yōu)化對于提高轉(zhuǎn)化效率至關重要。不同的畢赤酵母菌株可能對電轉(zhuǎn)化參數(shù)有不同的要求，需要進行摸索。在篩選陽性轉(zhuǎn)化子時，菌落 PCR 和 Southern blotting 兩種方法相結合能夠更準確地確定基因整合情況，尤其是區(qū)分單拷貝和多拷貝整合，這對于后續(xù)表達量的調(diào)控有重要意義。

（三）表達條件優(yōu)化的意義

通過對誘導時間和甲醇濃度的優(yōu)化，能夠顯著提高 Cryptonin 的表達量。甲醇作為誘導劑，其濃度過高可能對細胞產(chǎn)生毒性，影響蛋白表達和細胞活性；濃度過低則無法有效誘導蛋白表達。合適的誘導時間也需要根據(jù)細胞生長狀態(tài)和蛋白表達動態(tài)來確定，這需要大量的實驗摸索。

（四）純化與鑒定方法的選擇

鎳瓊脂糖凝膠親和層析對于帶有組氨酸標簽的重組蛋白具有較好的純化效果，但可能存在一些非特異性吸附，需要通過優(yōu)化洗滌和洗脫條件來提高純度。HPLC 作為一種高分辨率的純化方法，能夠進一步去除雜質(zhì)，獲得高純度的蛋白。在鑒定方面，質(zhì)譜分析和 N - 末端氨基酸序列測定從不同角度對蛋白進行了準確鑒定，而抗菌活性檢測則直接驗證了表達產(chǎn)物的功能，為其應用價值提供了依據(jù)。

五、結論

本研究成功實現(xiàn)了蟬抗菌肽 Cryptonin 在畢赤酵母中的高效表達，并通過多種方法對表達產(chǎn)物進行了準確的純化和鑒定。表達的 Cryptonin 具有良好的抗菌活性，為其進一步的大規(guī)模生產(chǎn)和在醫(yī)藥領域的應用研究提供了重要的實驗數(shù)據(jù)和技術支持。未來可進一步研究 Cryptonin 的作用機制，優(yōu)化表達體系以提高產(chǎn)量，并開展其在體內(nèi)的抗菌效果和安全性評估等相關研究。