一、引言

染色體異常是導(dǎo)致胎兒先天畸形、智力低下、發(fā)育遲緩等多種不良妊娠結(jié)局的重要原因之一。產(chǎn)前診斷對于發(fā)現(xiàn)染色體異常胎兒，為家庭和臨床提供決策依據(jù)具有至關(guān)重要的作用。傳統(tǒng)的染色體核型分析是產(chǎn)前診斷的金標準，但該方法存在操作復(fù)雜、耗時長（一般需要數(shù)天至數(shù)周）等缺點，尤其是對于急需診斷結(jié)果的孕婦（如孕周較大等情況）并不十分理想。

熒光原位雜交（FISH）技術(shù)作為一種分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)，具有快速、靈敏、特異性高的特點，能夠在較短時間內(nèi)對羊水細胞中的特定染色體異常進行檢測。它可以檢測染色體的數(shù)目異常，如 21 - 三體、18 - 三體、13 - 三體等，以及部分染色體結(jié)構(gòu)異常。近年來，F(xiàn)ISH 技術(shù)在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，為染色體異常的早期診斷提供了一種有效的手段，大大提高了產(chǎn)前診斷的效率和質(zhì)量。

二、熒光原位雜交技術(shù)原理

FISH 技術(shù)是基于核酸分子雜交原理。它利用已知序列的熒光標記核酸探針與細胞內(nèi)的染色體 DNA 進行特異性雜交。這些探針可以特異性地識別染色體上特定的基因序列或區(qū)域。當探針與目標 DNA 序列互補結(jié)合后，在熒光顯微鏡下可以觀察到熒光信號。通過對熒光信號的數(shù)量、位置和分布等特征的分析，可以判斷染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)是否正常。

例如，對于檢測 21 - 三體綜合征，可以使用針對 21 號染色體特異性的探針。正常細胞中，在熒光顯微鏡下會觀察到兩個特定的熒光信號（對應(yīng)兩條 21 號染色體），而如果是 21 - 三體細胞，則會觀察到三個熒光信號。

三、實驗材料與方法

（一）羊水樣本采集

羊水樣本一般在孕中期（16 - 22 周）通過羊膜腔穿刺術(shù)獲取。在超聲引導(dǎo)下，將穿刺針經(jīng)腹壁、子宮壁刺入羊膜腔，抽取一定量（一般 10 - 20ml）的羊水。采集過程中要嚴格遵循無菌操作原則，以防止感染。采集后的羊水應(yīng)立即送檢，避免長時間放置導(dǎo)致細胞活性降低。

（二）羊水細胞處理

1. 離心分離
將采集到的羊水樣本在低溫離心機中以適當?shù)霓D(zhuǎn)速（如 1000 - 1500rpm）離心 10 - 15 分鐘，使羊水細胞沉淀在離心管底部。

2. 細胞培養(yǎng)（可選）
對于需要進一步培養(yǎng)以獲得更多細胞的情況，可以將沉淀的羊水細胞接種到特定的培養(yǎng)基中，在合適的培養(yǎng)條件（37℃、5% CO?）下培養(yǎng)數(shù)天。培養(yǎng)后的細胞可以獲得更好的細胞形態(tài)和更多的染色體信息，但這會增加診斷時間。在一些緊急情況下，可以直接使用未經(jīng)培養(yǎng)的羊水細胞進行 FISH 檢測。

3. 細胞固定
無論是培養(yǎng)后的細胞還是直接離心獲得的細胞，都需要進行固定處理。常用的固定劑為甲醇 - 冰醋酸（3:1）混合液。將細胞懸浮在固定劑中，反復(fù)固定幾次，以保證細胞結(jié)構(gòu)完整，染色體形態(tài)清晰，便于后續(xù)雜交操作。

（三）探針選擇與標記

1. 探針類型
根據(jù)需要檢測的染色體異常類型選擇合適的探針。常見的探針包括染色體著絲粒探針、染色體特異性位點探針和全染色體涂抹探針等。例如，對于常見的三體綜合征診斷，常使用著絲粒探針。對于檢測染色體易位等結(jié)構(gòu)異常，可以使用特異性位點探針或全染色體涂抹探針。

2. 探針標記
探針標記有直接標記和間接標記兩種方式。直接標記是將熒光素（如 FITC、Cy3、Cy5 等）直接連接到探針上。間接標記則是先將生物素等標記物連接到探針上，然后在雜交后通過與熒光標記的親和物質(zhì)（如熒光標記的抗生物素抗體或抗抗體）反應(yīng)來顯示熒光信號。直接標記操作相對簡單，而間接標記可以通過信號放大提高檢測靈敏度。

（四）雜交過程

1. 預(yù)處理
將固定好的羊水細胞涂片或滴片在適當?shù)念A(yù)處理液（如 70% 甲酰胺 / 2×SSC）中處理，使染色體 DNA 變性，成為單鏈狀態(tài)，便于與探針雜交。處理溫度和時間需要嚴格控制，一般在 70 - 75℃處理數(shù)分鐘。

2. 雜交反應(yīng)
將標記好的探針與預(yù)處理后的羊水細胞樣本混合，滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，在合適的雜交溫度（一般 37℃）下進行雜交反應(yīng)。雜交反應(yīng)時間根據(jù)探針類型和長度不同而有所差異，一般需要數(shù)小時至過夜。在雜交過程中，探針與染色體上的目標 DNA 序列特異性結(jié)合。

（五）檢測與結(jié)果分析

1. 洗滌
雜交完成后，需要進行嚴格的洗滌步驟，以去除未結(jié)合的探針。洗滌液一般采用不同濃度的 SSC 溶液和吐溫 - 20。通過逐步降低鹽濃度和溫和的洗滌劑作用，將非特異性結(jié)合的探針洗脫，而保留特異性結(jié)合的探針。

2. 熒光顯微鏡觀察
將洗滌后的載玻片在熒光顯微鏡下觀察。使用合適的濾光片來激發(fā)和檢測不同熒光標記的信號。觀察細胞內(nèi)熒光信號的數(shù)量、位置和形態(tài)。對于染色體數(shù)目異常的診斷，根據(jù)特定染色體探針的熒光信號數(shù)量進行判斷。例如，正常細胞中針對某條染色體的兩個熒光信號，若出現(xiàn)三個或更多，則提示該染色體數(shù)目異常。對于結(jié)構(gòu)異常，觀察熒光信號的分布和形態(tài)變化，如染色體易位可能導(dǎo)致兩個不同染色體的熒光信號在空間上出現(xiàn)異常的連接或融合。

3. 結(jié)果判斷標準
建立嚴格的結(jié)果判斷標準非常重要。對于熒光信號的強度、清晰度和特異性都要有明確的界定。一般要求熒光信號明亮、清晰，與背景有明顯區(qū)別。同時，要對多個細胞進行觀察和分析，以減少假陽性和假陰性結(jié)果。對于一些臨界結(jié)果，可能需要重復(fù)實驗或結(jié)合其他診斷方法進一步確認。

四、FISH 技術(shù)在診斷染色體異常中的應(yīng)用

（一）常見染色體數(shù)目異常診斷

21 - 三體綜合征（唐氏綜合征）
使用 21 號染色體著絲粒探針進行 FISH 檢測，可以快速準確地檢測羊水細胞中的 21 - 三體情況。與傳統(tǒng)核型分析相比，F(xiàn)ISH 技術(shù)可以在 24 - 48 小時內(nèi)得出結(jié)果，大大縮短了診斷時間。在臨床實踐中，對于高齡孕婦或唐篩高風險孕婦的羊水樣本，F(xiàn)ISH 檢測為及時發(fā)現(xiàn) 21 - 三體胎兒提供了有力支持。

18 - 三體綜合征（愛德華茲綜合征）和 13 - 三體綜合征（帕陶綜合征）
類似地，針對 18 號和 13 號染色體的著絲粒探針也可用于檢測相應(yīng)的三體綜合征。這些染色體異常往往伴隨著嚴重的胎兒畸形和發(fā)育障礙，早期診斷可以為家庭和醫(yī)生提供決策依據(jù)，如是否選擇終止妊娠等。

（二）染色體結(jié)構(gòu)異常診斷

1. 染色體易位
對于一些攜帶染色體平衡易位的夫婦，其胎兒有一定的染色體異常風險。通過使用特異性位點探針或全染色體涂抹探針，可以檢測羊水細胞中是否存在染色體易位情況。例如，在檢測羅伯遜易位時，FISH 技術(shù)可以清晰地顯示兩條近端著絲粒染色體之間的融合情況，幫助判斷胎兒是否遺傳了易位染色體，以及是否存在不平衡易位導(dǎo)致的基因缺失或重復(fù)。

2. 染色體缺失和重復(fù)
某些染色體微缺失和微重復(fù)綜合征（如 DiGeorge 綜合征、Prader - Willi 綜合征等）與特定染色體區(qū)域的基因缺失或重復(fù)有關(guān)。通過選擇覆蓋這些關(guān)鍵區(qū)域的探針，F(xiàn)ISH 技術(shù)可以檢測羊水細胞中是否存在相應(yīng)的染色體異常。這種檢測對于那些有家族遺傳病史或超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常的情況尤為重要。

五、FISH 技術(shù)與傳統(tǒng)染色體核型分析的比較

（一）優(yōu)勢

1. 快速診斷
FISH 技術(shù)可以在短時間內(nèi)（一般 1 - 2 天）得出結(jié)果，而傳統(tǒng)核型分析需要較長時間（一般 7 - 14 天）。這對于孕周較大、需要盡快得到診斷結(jié)果的孕婦非常有利，可以及時采取相應(yīng)的措施。

2. 特異性高
由于使用的是特異性探針，FISH 技術(shù)對于特定染色體異常的檢測具有很高的特異性。尤其是對于常見的三體綜合征等，其診斷準確性與傳統(tǒng)核型分析相當。

3. 可檢測染色體微小異常
對于一些染色體微缺失和微重復(fù)等微小結(jié)構(gòu)異常，FISH 技術(shù)在選擇合適探針的情況下能夠進行檢測，而傳統(tǒng)核型分析可能由于分辨率的限制而難以發(fā)現(xiàn)。

（二）局限性

1. 檢測范圍有限
FISH 技術(shù)只能檢測已知序列的特定染色體異常，需要根據(jù)預(yù)先設(shè)計的探針來進行檢測。如果存在未知的染色體異常或探針未覆蓋的區(qū)域異常，則可能會漏診。而傳統(tǒng)核型分析可以對整個染色體組進行全面觀察。

2. 結(jié)果解讀相對復(fù)雜
FISH 技術(shù)的結(jié)果解讀需要對熒光信號有準確的判斷，對于一些信號不清晰或復(fù)雜的情況（如嵌合體等），解讀難度較大。而且不同實驗室之間可能存在一定的結(jié)果判斷差異，需要建立標準化的操作和解讀流程。

六、臨床案例分析

（一）病例資料

某孕婦，38 歲，孕 20 周，唐篩結(jié)果顯示 21 - 三體高風險。超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒頸部透明層增厚。經(jīng)羊膜腔穿刺獲取羊水樣本進行 FISH 檢測和傳統(tǒng)核型分析。

（二）檢測過程與結(jié)果

1. FISH 檢測
使用 21 號染色體著絲粒探針進行 FISH 檢測，在羊水細胞中觀察到三個明亮的熒光信號，提示 21 - 三體可能。整個 FISH 檢測過程在 24 小時內(nèi)完成。

2. 傳統(tǒng)核型分析
同時進行的傳統(tǒng)核型分析在 10 天后得出結(jié)果，確診為 21 - 三體綜合征。

（三）討論

在這個案例中，FISH 技術(shù)快速地為臨床提供了初步診斷結(jié)果，為后續(xù)的咨詢和決策提供了及時的信息。雖然傳統(tǒng)核型分析是確診的金標準，但 FISH 技術(shù)的快速診斷優(yōu)勢在這種情況下顯得尤為重要，可以避免孕婦長時間的焦慮等待。同時，兩者結(jié)果的一致性也證明了 FISH 技術(shù)在 21 - 三體診斷中的可靠性。

七、結(jié)論

熒光原位雜交技術(shù)在羊水細胞染色體異常診斷中具有重要的應(yīng)用價值。它以其快速、靈敏、特異性高的特點，為產(chǎn)前診斷染色體異常尤其是常見的三體綜合征和部分結(jié)構(gòu)異常提供了一種有效的檢測手段。雖然該技術(shù)存在一定的局限性，但與傳統(tǒng)染色體核型分析相結(jié)合，可以大大提高產(chǎn)前診斷的準確性和效率。在臨床實踐中，應(yīng)根據(jù)孕婦的具體情況（如孕周、唐篩結(jié)果、超聲檢查結(jié)果等）合理選擇診斷方法，充分發(fā)揮 FISH 技術(shù)的優(yōu)勢，為降低染色體異常患兒的出生率、提高人口素質(zhì)做出貢獻。隨著 FISH 技術(shù)的不斷發(fā)展，如新型探針的開發(fā)、檢測流程的優(yōu)化等，其在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的應(yīng)用前景將更加廣闊。同時，也需要進一步加強實驗室質(zhì)量控制和人員培訓(xùn)，以確保檢測結(jié)果的準確性和可靠性。