枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）憑借其生長(zhǎng)迅速、遺傳背景清晰、分泌蛋白能力強(qiáng)以及非致病性等諸多優(yōu)良特性，已然成為工業(yè)微生物領(lǐng)域生產(chǎn)酶制劑、生物農(nóng)藥，以及生物技術(shù)范疇開(kāi)展基因克隆、表達(dá)調(diào)控研究的熱門(mén)宿主菌株。在現(xiàn)代生物技術(shù)蓬勃發(fā)展浪潮下，借助基因工程手段對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行定向遺傳改造，精準(zhǔn)導(dǎo)入外源有益基因以拓展其功能特性，是挖掘其潛在應(yīng)用價(jià)值的核心技術(shù)路徑之一。
電轉(zhuǎn)化法作為一種將外源 DNA 高效導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的物理轉(zhuǎn)化手段，在枯草芽孢桿菌基因操作中占據(jù)關(guān)鍵地位。其原理是基于高壓電脈沖瞬間作用于細(xì)胞，致使細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆性穿孔，形成短暫的跨膜通道，為外源 DNA 分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部創(chuàng)造契機(jī)。然而，該過(guò)程不可避免地會(huì)對(duì)細(xì)胞造成多重?fù)p傷，諸如電擊致使細(xì)胞膜完整性破壞、細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)失衡、蛋白質(zhì)變性以及核酸損傷等不良后果，這直接導(dǎo)致細(xì)胞存活率銳減、轉(zhuǎn)化效率低下且重復(fù)性欠佳，極大限制了枯草芽孢桿菌基因工程改造的高效開(kāi)展。
海藻糖（Trehalose），作為一種由兩分子葡萄糖通過(guò) α,α-1,1 - 糖苷鍵連接構(gòu)成的非還原性二糖，在自然界廣泛分布于多種環(huán)境生物體內(nèi)，恰似天然的 “細(xì)胞保護(hù)劑"。諸多過(guò)往研究揭示，海藻糖具備非凡的生物保護(hù)特性，在高溫、冷凍、干燥、高滲透壓等嚴(yán)苛脅迫環(huán)境下，能夠借助與生物大分子（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸）特異性相互作用，穩(wěn)固其天然構(gòu)象、維持分子間正常相互作用，進(jìn)而有效保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能完整性。鑒于此更好優(yōu)勢(shì)，本研究創(chuàng)新性地將海藻糖引入枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化流程，深度探究其在優(yōu)化電轉(zhuǎn)化效率層面的可行性與作用機(jī)制，期望構(gòu)建一套切實(shí)可行、高效穩(wěn)健的枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化優(yōu)化方案，為相關(guān)科研與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用注入嶄新活力。
菌株與質(zhì)粒：枯草芽孢桿菌野生型菌株（實(shí)驗(yàn)室保藏，具備良好遺傳穩(wěn)定性與生長(zhǎng)特性）；攜帶綠色熒光蛋白基因（GFP）的外源質(zhì)粒（用于轉(zhuǎn)化效率直觀評(píng)估，其表達(dá)產(chǎn)物易于熒光檢測(cè)與量化分析）。
主要試劑：海藻糖（分析純，購(gòu)自生物試劑公司，純度≥99%）；電轉(zhuǎn)化緩沖液（依據(jù)枯草芽孢桿菌特性自研調(diào)配，含適量甘露醇、HEPES 等成分以維持滲透壓與 pH 穩(wěn)定）；溶菌酶（用于細(xì)胞壁預(yù)處理，酶活單位達(dá)標(biāo)，保障處理效果均勻一致）；DNA 提取與純化試劑盒（高效提取高純度、完整無(wú)缺的外源質(zhì)粒 DNA）；常規(guī)生化試劑（如氯化鈉、磷酸二氫鉀等用于培養(yǎng)基配制）。
儀器設(shè)備：電轉(zhuǎn)化儀（精準(zhǔn)調(diào)控電脈沖參數(shù)，輸出電壓、電容、電阻等參數(shù)誤差極小）；高速冷凍離心機(jī)（具備強(qiáng)大離心力與溫控精度，滿足細(xì)胞分離、洗滌步驟要求）；熒光顯微鏡（高分辨率成像，靈敏捕捉 GFP 熒光信號(hào)，準(zhǔn)確量化轉(zhuǎn)化子數(shù)目）；分光光度計(jì)（精準(zhǔn)測(cè)定細(xì)胞濃度、DNA 濃度，確保實(shí)驗(yàn)體系用量精準(zhǔn)把控）；恒溫?fù)u床（精準(zhǔn)模擬微生物生長(zhǎng)環(huán)境，溫度、轉(zhuǎn)速調(diào)控精準(zhǔn)，保障菌株穩(wěn)定培養(yǎng)）。
枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)與預(yù)處理：挑取枯草芽孢桿菌單菌落接種至 LB 液體培養(yǎng)基（含胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L、氯化鈉 10 g/L，pH 調(diào)至 7.0 - 7.2），置于 37℃、200 rpm 恒溫?fù)u床過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD???約為 0.6 - 0.8）。隨后，冰浴冷卻 15 - 20 分鐘使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，4℃、5000 rpm 離心 10 分鐘收集菌體，用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化緩沖液洗滌 2 - 3 次以去除殘留培養(yǎng)基成分，并重懸于適量電轉(zhuǎn)化緩沖液。在此基礎(chǔ)上，設(shè)置多組實(shí)驗(yàn)組，分別添加不同終濃度（0、50 mM、100 mM、150 mM、200 mM）的海藻糖，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組（不含海藻糖），37℃溫和振蕩孵育 30 - 60 分鐘，部分實(shí)驗(yàn)組添加適量溶菌酶（終濃度約 0.5 - 1.0 mg/mL）協(xié)同預(yù)處理細(xì)胞壁，增強(qiáng)細(xì)胞通透性，處理完畢再次冰浴、離心、洗滌后備用。
外源質(zhì)粒 DNA 的準(zhǔn)備：運(yùn)用商業(yè)化 DNA 提取與純化試劑盒，依照操作手冊(cè)從大腸桿菌宿主菌中提取攜帶 GFP 基因的質(zhì)粒 DNA，經(jīng)分光光度計(jì)精確定量濃度后，稀釋至統(tǒng)一工作濃度（約 50 - 100 ng/μL），確保各轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系中外源 DNA 量恒定且質(zhì)量可靠。
電轉(zhuǎn)化操作：將預(yù)處理后的枯草芽孢桿菌細(xì)胞懸液與等體積的外源質(zhì)粒 DNA 輕柔混勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中（電極間距恒定為 2 mm），置于電轉(zhuǎn)化儀中，設(shè)置多組不同電脈沖參數(shù)組合（電壓范圍 500 - 2500 V，電容 5 - 25 μF，電阻 200 - 1000 Ω）進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，每組參數(shù)設(shè)置 3 - 5 個(gè)平行樣以保障數(shù)據(jù)重復(fù)性與可靠性。電擊完成后，迅速添加預(yù)冷的 LB 液體培養(yǎng)基（1 mL），37℃、100 rpm 低速?gòu)?fù)蘇培養(yǎng) 1 - 2 小時(shí)，助力細(xì)胞修復(fù)受損結(jié)構(gòu)、恢復(fù)正常生理代謝并表達(dá)外源基因。
轉(zhuǎn)化子篩選與計(jì)數(shù)：復(fù)蘇培養(yǎng)后的菌液適度稀釋后，均勻涂布于含相應(yīng)抗生素（依據(jù)外源質(zhì)?？剐詷?biāo)記選擇，如氨芐青霉素、卡那霉素等）的 LB 固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng) 12 - 16 小時(shí)，待菌落長(zhǎng)出后，借助熒光顯微鏡在藍(lán)光激發(fā)下觀測(cè) GFP 熒光表達(dá)情況，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子（呈現(xiàn)明亮綠色熒光菌落），并人工計(jì)數(shù)各平板上轉(zhuǎn)化子數(shù)目，結(jié)合稀釋倍數(shù)換算出每微克外源 DNA 對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)化子形成單位（CFU/μg DNA），以此作為衡量電轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。
經(jīng)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，不同海藻糖濃度下枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化效率呈現(xiàn)顯著差異（圖 1）。在未添加海藻糖的對(duì)照組中，電轉(zhuǎn)化效率處于相對(duì)較低水平，僅約（1.2 ± 0.3）× 102 CFU/μg DNA。伴隨海藻糖濃度逐步遞增，轉(zhuǎn)化效率呈現(xiàn)先上升后略有下降的趨勢(shì)，當(dāng)海藻糖終濃度達(dá) 100 mM 時(shí)，轉(zhuǎn)化效率攀升至峰值，約為（5.6 ± 0.8）× 102 CFU/μg DNA，相較于對(duì)照組提升近 4.7 倍。這充分彰顯適宜濃度海藻糖對(duì)電轉(zhuǎn)化進(jìn)程的積極促進(jìn)作用，推測(cè)是因其有效維護(hù)了細(xì)胞在電擊前后的結(jié)構(gòu)完整性，減少 DNA 進(jìn)入阻礙；而過(guò)高濃度下，可能因溶液滲透壓過(guò)高對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生額外脅迫，抵消部分保護(hù)優(yōu)勢(shì)，致使轉(zhuǎn)化效率有所回落。
固定海藻糖最佳濃度（100 mM），深入探究不同預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)（0、15、30、45、60 分鐘）對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響規(guī)律（圖 2）。結(jié)果清晰表明，預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)在 0 - 30 分鐘區(qū)間內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率隨時(shí)間延長(zhǎng)穩(wěn)步上揚(yáng)，30 分鐘時(shí)達(dá)效果，約（6.2 ± 0.7）× 102 CFU/μg DNA；超出此時(shí)長(zhǎng)，效率漸趨平穩(wěn)乃至微降。這意味著適當(dāng)時(shí)長(zhǎng)預(yù)處理為海藻糖與細(xì)胞充分作用、施展保護(hù)效能提供充裕時(shí)機(jī)，然過(guò)度延長(zhǎng)并無(wú)額外顯著增益，契合細(xì)胞生理響應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征，為后續(xù)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程確定精準(zhǔn)時(shí)間參數(shù)。
進(jìn)一步考察海藻糖與溶菌酶聯(lián)合預(yù)處理方案效果（表 1）。單獨(dú)使用溶菌酶預(yù)處理時(shí)，電轉(zhuǎn)化效率較對(duì)照組有一定提升，達(dá)（2.1 ± 0.4）× 102 CFU/μg DNA；單獨(dú)添加海藻糖（100 mM，30 分鐘）對(duì)應(yīng)效率為（5.6 ± 0.8）× 102 CFU/μg DNA；而二者協(xié)同作用下，轉(zhuǎn)化效率飆升至（8.5 ± 1.2）× 102 CFU/μg DNA，顯著優(yōu)于各自單獨(dú)處理效果。此現(xiàn)象歸因于溶菌酶適度削弱細(xì)胞壁屏障，協(xié)同海藻糖強(qiáng)化細(xì)胞膜穩(wěn)定性，雙管齊下為外源 DNA 順暢進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部開(kāi)辟更優(yōu)路徑，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率的疊加式增長(zhǎng)。
| 預(yù)處理方式 | 電轉(zhuǎn)化效率（CFU/μg DNA） |
|---|
| 對(duì)照組（無(wú)預(yù)處理） | （1.2 ± 0.3）× 102 |
| 溶菌酶單獨(dú)處理 | （2.1 ± 0.4）× 102 |
| 海藻糖（100 mM，30 分鐘）單獨(dú)處理 | （5.6 ± 0.8）× 102 |
| 海藻糖（100 mM，30 分鐘） + 溶菌酶協(xié)同處理 | （8.5 ± 1.2）× 102 |
在海藻糖及其協(xié)同預(yù)處理確定最佳條件基礎(chǔ)上，精細(xì)優(yōu)化電脈沖參數(shù)。經(jīng)多輪摸索，當(dāng)電壓設(shè)定為 1500 V、電容 15 μF、電阻 600 Ω 時(shí)，結(jié)合海藻糖（100 mM，30 分鐘）與溶菌酶協(xié)同預(yù)處理，枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化效率一舉突破至（1.2 ± 0.2）× 103 CFU/μg DNA，相較于初始未優(yōu)化狀態(tài)實(shí)現(xiàn)近 10 倍躍升，成功構(gòu)建一套高效電轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)基因工程操作筑牢根基。
本研究開(kāi)創(chuàng)性地將海藻糖融入枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化流程，通過(guò)全方面、深層次探究其在濃度、預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)、協(xié)同因素及整體轉(zhuǎn)化流程各環(huán)節(jié)作用機(jī)制，實(shí)現(xiàn)電轉(zhuǎn)化效率質(zhì)的飛躍。從細(xì)胞微觀層面解析，海藻糖憑借自身更好理化性質(zhì)，于電擊瞬間緊密結(jié)合細(xì)胞膜磷脂雙分子層，加固膜結(jié)構(gòu)、緩和電場(chǎng)誘導(dǎo)的膜穿孔損傷，降低膜修復(fù)能耗；于分子尺度，它環(huán)繞 DNA 分子，抵御自由基、離子沖擊，保障外源 DNA 完整，提升攝入整合幾率。與溶菌酶協(xié)同中，二者靶向細(xì)胞壁與膜，分工協(xié)作突破天然屏障。
在電轉(zhuǎn)化參數(shù)優(yōu)化維度，海藻糖的存在拓寬了參數(shù)適配范圍，以往因損傷顧慮而受限的高電壓、高電容設(shè)置，如今在其護(hù)航下得以啟用，進(jìn)一步增強(qiáng)電穿孔效果與轉(zhuǎn)化效能。此優(yōu)化體系不僅為枯草芽孢桿菌在異源蛋白高效表達(dá)、新型代謝途徑構(gòu)建等基因工程實(shí)踐提供強(qiáng)勁技術(shù)支撐，其蘊(yùn)含的基于小分子糖類保護(hù)劑提升微生物電轉(zhuǎn)化效率思路，對(duì)大腸桿菌、乳酸菌等其他微生物電轉(zhuǎn)化優(yōu)化亦具借鑒價(jià)值，有望拓展至更廣泛微生物領(lǐng)域，助力現(xiàn)代生物技術(shù)多場(chǎng)景應(yīng)用革新。
綜合而言，本研究成功構(gòu)建以海藻糖為核心優(yōu)化因子的枯草芽孢桿菌高效電轉(zhuǎn)化體系，明確 100 mM 海藻糖經(jīng) 30 分鐘預(yù)處理，協(xié)同溶菌酶及精細(xì)電脈沖參數(shù)（1500 V、15 μF、600 Ω）配置，能使電轉(zhuǎn)化效率從傳統(tǒng)方法的低水平實(shí)現(xiàn)近 10 倍攀升。這一成果攻克了枯草芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化效率瓶頸難題，強(qiáng)化其作為基因工程優(yōu)良宿主菌株優(yōu)勢(shì)，為相關(guān)產(chǎn)業(yè)（如生物制藥、綠色化工）與科研創(chuàng)新注入澎湃動(dòng)力，后續(xù)可圍繞海藻糖與細(xì)胞深層次互作機(jī)制開(kāi)展持續(xù)探究，進(jìn)一步挖掘潛能、拓展應(yīng)用邊界。
