引言

神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）具有自我更新能力和多向分化潛能，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的重要載體。通過基因工程技術(shù)將外源基因?qū)隢SCs，可以實(shí)現(xiàn)基因治療的目的。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）作為一種報(bào)告基因，具有表達(dá)穩(wěn)定、易于檢測的特點(diǎn)，常被用于標(biāo)記和追蹤細(xì)胞。

脂質(zhì)體作為一種有效的基因轉(zhuǎn)染載體，通過靜電相互作用將DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞。脂質(zhì)體表面帶有正電荷，可以與核酸磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷相互作用形成復(fù)合物，進(jìn)而被細(xì)胞膜吸附，通過內(nèi)吞或融合作用將外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法具有操作簡便、轉(zhuǎn)染效率高的優(yōu)點(diǎn)，適用于多種細(xì)胞類型。

構(gòu)建脂質(zhì)體介導(dǎo)的EGFP轉(zhuǎn)染NSCs體系，不僅可以評估NSCs作為基因治療載體的潛力，還可以為轉(zhuǎn)染其他功能基因奠定基礎(chǔ)。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，提高轉(zhuǎn)染效率，可以進(jìn)一步推動(dòng)NSCs在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

• 細(xì)胞：胎鼠、新生大鼠、成年大鼠海馬中分離的NSCs。

• 試劑：某品牌無血清DMEM/F12培養(yǎng)液、某品牌添加劑B27、某品牌堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、某品牌表皮細(xì)胞生長因子（EGF）、某品牌脂質(zhì)體試劑（TransFast）、某品牌G418、某品牌pIRES2-EGFP質(zhì)粒。

• 儀器：某品牌微量移液器、某品牌熒光顯微鏡、某品牌倒置顯微鏡、某品牌臺式離心機(jī)、某品牌恒溫水浴箱、某品牌渦旋振蕩器、某品牌血球計(jì)數(shù)板。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 NSCs的分離與培養(yǎng)

（1）從胎鼠、新生大鼠、成年大鼠海馬中分離NSCs，采用NSC克隆懸浮法。
（2）選用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，添加B27、bFGF及EGF進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)。
（3）采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測NSC標(biāo)志物Nestin的表達(dá)及分化后細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）和2,3-環(huán)核甘酸磷酸二脂酶（CNP）的表達(dá)。

2.2 胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞離體后存活時(shí)間研究

（1）將胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，分為37℃組和4℃組。
（2）37℃組在1/2、1、2、3、4小時(shí)觀察細(xì)胞生長狀態(tài)；4℃組在1/2、1、2、3、4天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

2.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)EGFP轉(zhuǎn)染NSCs

（1）將NSCs培養(yǎng)至適合轉(zhuǎn)染的狀態(tài)（細(xì)胞生長至70-90%的匯合度）。
（2）準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA，按照試劑說明書比例將轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA混合在適當(dāng)?shù)木彌_液中，輕輕混合并在室溫下孵育一定時(shí)間，讓轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成。
（3）將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入含細(xì)胞的培養(yǎng)皿或板中，輕輕搖勻，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物與細(xì)胞均勻接觸。
（4）將細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育4-6小時(shí)，促進(jìn)轉(zhuǎn)染復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞。
（5）轉(zhuǎn)染后更換為新鮮的完整培養(yǎng)基，減少轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞的潛在毒性。

2.4 轉(zhuǎn)染效率評估

（1）在轉(zhuǎn)染后24-48小時(shí)，通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，評估轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的影響。
（2）使用熒光顯微鏡檢測報(bào)告基因（EGFP）的表達(dá)，評估轉(zhuǎn)染效率。

2.5 移植與觀察

（1）將篩選后的NSCs立體定向儀移植入大鼠側(cè)腦室。
（2）分別在移植后4周、8周、12周、15周進(jìn)行大鼠腦組織冰凍切片制作，熒光觀察。

結(jié)果

1. NSCs的培養(yǎng)與鑒定

培養(yǎng)的NSCs Nestin抗體標(biāo)記陽性，分化后細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性抗原。這表明分離培養(yǎng)的NSCs具有較高的純度，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2. 胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞離體后存活時(shí)間

在37℃組，腦組織離體后1小時(shí)，已無法培養(yǎng)出干細(xì)胞；在4℃組，離體后3天，仍可以培養(yǎng)出NSCs。這表明在低溫條件下，NSCs的存活時(shí)間延長，有利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。

3. 脂質(zhì)體介導(dǎo)EGFP轉(zhuǎn)染NSCs

（1）當(dāng)脂質(zhì)體劑量為8μl，質(zhì)粒（pIRES2-EGFP）劑量為6μg，復(fù)合物作用時(shí)間為6小時(shí)，3代時(shí)轉(zhuǎn)染效率高，為27.6%。隨著傳代次數(shù)的增加，轉(zhuǎn)染效率逐漸降低。3代G2-M期所占的比例也最高，轉(zhuǎn)染率與G2-M期存在一定的關(guān)系。
（2）G418最小致死濃度為5001μg/ml。
（3）MTT比色法測定同期未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染NSCs活性，兩組之間無顯著性差異（P>0.05），表明脂質(zhì)體介導(dǎo)的EGFP轉(zhuǎn)染對NSCs的活性無明顯影響。

4. 移植與觀察

將篩選后的NSCs立體定向儀移植入大鼠側(cè)腦室后，觀察綠色熒光的表達(dá)情況。隨著時(shí)間的推移，綠色熒光逐漸朝針口周圍擴(kuò)展。在2周可見綠色熒光，強(qiáng)度較弱；在4-8周熒光，隨后逐漸減弱至12周時(shí)熒光基本消失，15周時(shí)觀察不到任何的熒光。這表明EGFP在NSCs中能夠穩(wěn)定表達(dá)，并可以用于細(xì)胞的追蹤和標(biāo)記。

討論

1. 脂質(zhì)體介導(dǎo)EGFP轉(zhuǎn)染NSCs的優(yōu)化條件

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脂質(zhì)體劑量、質(zhì)粒劑量、復(fù)合物作用時(shí)間以及細(xì)胞傳代次數(shù)對轉(zhuǎn)染效率有顯著影響。通過優(yōu)化這些條件，可以提高轉(zhuǎn)染效率。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)脂質(zhì)體劑量為8μl，質(zhì)粒劑量為6μg，復(fù)合物作用時(shí)間為6小時(shí)，3代時(shí)轉(zhuǎn)染效率高。這些條件為后續(xù)的基因治療實(shí)驗(yàn)提供了重要的參考。

2. EGFP作為報(bào)告基因的應(yīng)用

EGFP作為一種報(bào)告基因，具有表達(dá)穩(wěn)定、易于檢測的特點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中，通過熒光顯微鏡可以清晰地觀察到EGFP在NSCs中的表達(dá)情況。這不僅可以用于評估轉(zhuǎn)染效率，還可以用于追蹤和標(biāo)記移植后的細(xì)胞。此外，EGFP的表達(dá)還可以作為細(xì)胞活性的一個(gè)指標(biāo)，為后續(xù)的細(xì)胞功能研究提供重要信息。

3. NSCs作為基因治療載體的潛力

NSCs具有自我更新能力和多向分化潛能，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的重要載體。通過基因工程技術(shù)將外源基因?qū)隢SCs，可以實(shí)現(xiàn)基因治療的目的。本實(shí)驗(yàn)成功地將EGFP導(dǎo)入NSCs，并觀察到其在體內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。這為NSCs作為基因治療載體提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為后續(xù)的功能基因轉(zhuǎn)染奠定了基礎(chǔ)。

4. 研究的創(chuàng)新與應(yīng)用前景

本研究的創(chuàng)新之處在于成功構(gòu)建了脂質(zhì)體介導(dǎo)的EGFP轉(zhuǎn)染NSCs體系，并優(yōu)化了轉(zhuǎn)染條件。通過這一體系，可以實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)染，為NSCs在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思路和方法。此外，本研究還為后續(xù)的功能基因轉(zhuǎn)染和疾病治療提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

在應(yīng)用前景方面，脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)具有操作簡便、轉(zhuǎn)染效率高的優(yōu)點(diǎn)，適用于多種細(xì)胞類型。通過將治療基因?qū)隢SCs，可以實(shí)現(xiàn)疾病的基因治療。此外，EGFP作為報(bào)告基因，可以用于追蹤和標(biāo)記移植后的細(xì)胞，為疾病的診斷和治療提供新的手段。

結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了脂質(zhì)體介導(dǎo)的EGFP轉(zhuǎn)染NSCs體系，并優(yōu)化了轉(zhuǎn)染條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脂質(zhì)體介導(dǎo)的EGFP轉(zhuǎn)染具有較高的轉(zhuǎn)染效率和長時(shí)間的表達(dá)。這一體系為NSCs作為基因治療載體提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為后續(xù)的功能基因轉(zhuǎn)染奠定了基礎(chǔ)。通過進(jìn)一步的研究和優(yōu)化，脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)有望在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療中發(fā)揮重要作用。