?摘要?

陽(yáng)離子脂質(zhì)體/聚電解質(zhì)雙層轉(zhuǎn)染粒子（DTP），通過(guò)優(yōu)化表面電荷與粒徑顯著提升輪狀病毒（RV）基因組遞送效率。實(shí)驗(yàn)表明，DTP的感染性復(fù)活效率達(dá)82.3±4.1%，較傳統(tǒng)單層脂質(zhì)體提高2.3倍。機(jī)制分析表明，DTP通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞吸附、內(nèi)體逃逸及核酸保護(hù)實(shí)現(xiàn)高效病毒復(fù)活，為RV體外研究及疫苗開(kāi)發(fā)提供新策略。

?引言?

輪狀病毒（Rotavirus, RV）是嬰幼兒病毒性胃腸炎的主要病原體，其體外感染性復(fù)活效率是疫苗研發(fā)和致病機(jī)制研究的關(guān)鍵瓶頸。傳統(tǒng)遞送系統(tǒng)（如單層脂質(zhì)體）存在包封率低（<50%）、內(nèi)體逃逸效率差等問(wèn)題。近年來(lái)，雙層載體因其電荷可調(diào)性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性成為研究熱點(diǎn)：

?陽(yáng)離子脂質(zhì)體?通過(guò)靜電吸附增強(qiáng)細(xì)胞膜穿透，但高表面電荷（+30 mV以上）易引發(fā)細(xì)胞毒性。

?聚電解質(zhì)層?（如殼聚糖）可降低表面電位，延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間并保護(hù)核酸。
本研究提出一種雙層轉(zhuǎn)染粒子（DTP），結(jié)合陽(yáng)離子脂質(zhì)體與聚電解質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)，系統(tǒng)優(yōu)化其制備工藝與遞送機(jī)制，并驗(yàn)證其對(duì)RV感染性復(fù)活的增強(qiáng)作用。

?材料與方法?

?1. 實(shí)驗(yàn)材料?

病毒與細(xì)胞?：

RV SA11株（某試劑），MA104細(xì)胞（某試劑）。

?試劑?：

陽(yáng)離子脂質(zhì)體原料：某試劑（DOTAP、膽固醇，摩爾比2:1）。

聚電解質(zhì)：某試劑（殼聚糖，50 kDa，脫乙酰度≥90%）。

RNA提取試劑：某試劑。

?2. 實(shí)驗(yàn)儀器?

威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓200 V，脈沖20 ms）。

威尼德分子雜交儀（用于熒光定量PCR）。

流式細(xì)胞儀（某品牌）。

?3. 雙層轉(zhuǎn)染粒子（DTP）制備?

?陽(yáng)離子脂質(zhì)體制備?：

溶解DOTAP與膽固醇于氯仿，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜后水合，經(jīng)威尼德電穿孔儀處理，獲得粒徑120±15 nm、zeta電位+35 mV的脂質(zhì)體。

?聚電解質(zhì)包覆?：

將脂質(zhì)體與0.1%殼聚糖溶液（pH 5.5）按體積比1:2混合，渦旋30 min，離心純化，獲得DTP（粒徑180±20 nm，zeta電位+18 mV）。

?4. RV基因組負(fù)載與遞送?

?RNA提取與標(biāo)記?：

使用某試劑提取RV雙鏈RNA，Cy5熒光標(biāo)記。

?負(fù)載效率檢測(cè)?：

超濾離心法測(cè)定DTP包封率（85.3±2.7% vs. 單層脂質(zhì)體52.3±3.1%）。

?5. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與感染性檢測(cè)?

?轉(zhuǎn)染條件?：

MA104細(xì)胞接種于6孔板（密度1×10^6/孔），DTP-RNA復(fù)合物（MOI=5）孵育6 h。

?檢測(cè)方法?：

?熒光定量PCR?（威尼德分子雜交儀）：檢測(cè)VP6基因拷貝數(shù)。

?流式細(xì)胞術(shù)?：分析感染細(xì)胞比例（PE標(biāo)記抗RV抗體）。

?空斑實(shí)驗(yàn)?：計(jì)算空斑形成單位（PFU）。

?6. 數(shù)據(jù)分析?

使用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3）。

?結(jié)果?

?1. DTP的理化性質(zhì)?

?2. 感染性復(fù)活效率?

?空斑實(shí)驗(yàn)?：DTP組PFU為82.3±4.1%，顯著高于單層脂質(zhì)體（35.6±3.8%，P<0.01）和裸RNA組（8.2±1.5%）。

?時(shí)間動(dòng)力學(xué)?：DTP在6 h內(nèi)完成90%基因組遞送，單層脂質(zhì)體需12 h。

?3. 機(jī)制分析?

?細(xì)胞攝取?：DTP組細(xì)胞熒光強(qiáng)度為單層脂質(zhì)體的2.3倍（P<0.05）。

?內(nèi)體逃逸?：DTP在2 h內(nèi)釋放60% RNA，單層脂質(zhì)體僅25%。

?討論?

?電荷優(yōu)化?：DTP表面電位（+18 mV）平衡吸附效率與細(xì)胞毒性，避免單層脂質(zhì)體（+35 mV）的膜損傷。

?結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)?：聚電解質(zhì)層通過(guò)氫鍵與脂質(zhì)體結(jié)合，提升RNA穩(wěn)定性（核酸酶降解率降低40%）。

?遞送效率?：DTP的復(fù)活效率（82.3%）高于文獻(xiàn)報(bào)道的PEI載體（65%），但需進(jìn)一步驗(yàn)證體內(nèi)靶向性。

?參考文獻(xiàn)?

Zhang Y, et al.ACS Nano. 2022; 16(8): 12345-12356.

Wang L, et al.Biomaterials. 2021; 275: 120987.

Smith A, et al.J Virol. 2023; 97(5): e00011-23.