摘要

通過(guò)威尼德電穿孔儀系統(tǒng)優(yōu)化大鼠腎小球系膜細(xì)胞（GMCs）原代培養(yǎng)的電轉(zhuǎn)染參數(shù)，結(jié)合某試劑細(xì)胞活性檢測(cè)體系篩選最佳轉(zhuǎn)染條件。實(shí)驗(yàn)確定電壓160 V、脈沖寬度25 ms時(shí)，轉(zhuǎn)染效率達(dá)68.5%，細(xì)胞存活率>85%，熒光蛋白表達(dá)持續(xù)14天以上，為腎臟疾病基因治療研究提供高效轉(zhuǎn)染方案。

引言

腎小球系膜細(xì)胞（GMCs）是腎臟濾過(guò)屏障的功能核心，其異常增殖與糖尿病腎病、IgA腎病等病理過(guò)程密切相關(guān)。原代GMCs的基因修飾研究對(duì)解析疾病機(jī)制至關(guān)重要，但該類細(xì)胞存在原代培養(yǎng)難度高、轉(zhuǎn)染效率低（通常<20%）等瓶頸。傳統(tǒng)脂質(zhì)體法易導(dǎo)致細(xì)胞毒性，而病毒轉(zhuǎn)染存在安全性風(fēng)險(xiǎn)，電穿孔技術(shù)因可控性強(qiáng)、適用范圍廣成為理想替代方案。

本研究基于威尼德電穿孔儀的高精度脈沖調(diào)控功能，針對(duì)大鼠原代GMCs建立電轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化體系。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，系統(tǒng)分析電壓、脈沖寬度、質(zhì)粒濃度等參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞活性的影響，結(jié)合某試劑熒光報(bào)告系統(tǒng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)基因表達(dá)持續(xù)性，為腎臟靶向基因治療提供可靠技術(shù)平臺(tái)。

實(shí)驗(yàn)材料與方法

1. 原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)

· 組織取材：取8周齡SD大鼠腎臟，灌注某試劑膠原酶IV（1 mg/mL）消化腎皮質(zhì)，200目篩網(wǎng)過(guò)濾獲取GMCs懸液。

· 原代培養(yǎng)：采用含某試劑內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（10 ng/mL）的DMEM/F12培養(yǎng)基（胎牛血清濃度15%），于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中傳代至第3代用于實(shí)驗(yàn)。

· 細(xì)胞鑒定：免疫熒光法檢測(cè)α-SMA、Desmin陽(yáng)性率（>90%），排除成纖維細(xì)胞污染。

2. 電轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

·質(zhì)粒制備：使用pEGFP-N1熒光報(bào)告質(zhì)粒（濃度1 μg/μL），經(jīng)某試劑質(zhì)粒大提試劑盒純化（內(nèi)毒素<0.1 EU/μg）。

·參數(shù)設(shè)置：威尼德電穿孔儀預(yù)設(shè)梯度參數(shù)：

o電壓：120 V、140 V、160 V、180 V；

o脈沖寬度：10 ms、15 ms、20 ms、25 ms；

o質(zhì)粒劑量：2 μg、4 μg、6 μg/1×10? cells。

·轉(zhuǎn)染流程：細(xì)胞懸液（密度2×10? cells/mL）與質(zhì)粒混合后轉(zhuǎn)移至威尼德電轉(zhuǎn)杯，脈沖處理后立即加入預(yù)溫培養(yǎng)基，24小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)基。

3. 效率與活性檢測(cè)

· 流式細(xì)胞術(shù)：轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用某試劑細(xì)胞消化液收集細(xì)胞，檢測(cè)EGFP陽(yáng)性率。

· CCK-8法：轉(zhuǎn)染24小時(shí)、72小時(shí)分別加入某試劑CCK-8溶液，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度計(jì)算存活率。

· 長(zhǎng)期表達(dá)監(jiān)測(cè)：連續(xù)培養(yǎng)14天，每日熒光顯微鏡（威尼德成像系統(tǒng)）記錄熒光強(qiáng)度衰減率。

4. 功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

· 靶基因轉(zhuǎn)染：選用TGF-β1 shRNA質(zhì)粒，按優(yōu)條件轉(zhuǎn)染后，qPCR檢測(cè)TGF-β1 mRNA抑制效率（某試劑SYBR Green Mix）。

· 細(xì)胞表型分析：劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移能力，某試劑EdU增殖試劑盒檢測(cè)細(xì)胞周期變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 電轉(zhuǎn)染參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

·電壓與脈沖寬度協(xié)同效應(yīng)：160 V/25 ms組合下，轉(zhuǎn)染效率達(dá)68.5±3.2%（圖1A），顯著高于140 V/20 ms組的41.7%（P<0.01），且細(xì)胞存活率保持85.3±2.1%。

·質(zhì)粒濃度閾值：當(dāng)質(zhì)粒劑量>4 μg時(shí)，轉(zhuǎn)染效率無(wú)顯著提升（P>0.05），但存活率下降至76.8%（6 μg組）。

2. 轉(zhuǎn)染體系穩(wěn)定性驗(yàn)證

· 熒光蛋白表達(dá)持續(xù)14天，第7天熒光強(qiáng)度達(dá)峰值（相對(duì)強(qiáng)度1580±120 AU），第14天仍維持初始強(qiáng)度的62.3%。

· 威尼德電穿孔儀的脈沖波形穩(wěn)定性（CV=1.2%）確保實(shí)驗(yàn)重復(fù)性，三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率差異<5%。

3. 功能基因遞送有效性

· TGF-β1 shRNA轉(zhuǎn)染后，mRNA表達(dá)量降低78.4±5.6%（P<0.001），Western blot顯示蛋白水平抑制率達(dá)72.3%。

· 轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移速度減緩41.7%，EdU陽(yáng)性率下降29.5%（P<0.05），證實(shí)基因修飾成功調(diào)控細(xì)胞表型。

4. 儀器與試劑性能優(yōu)勢(shì)

· 威尼德電穿孔儀的溫控模塊（4℃預(yù)冷）使細(xì)胞存活率提升18%，某試劑無(wú)血清電轉(zhuǎn)染緩沖液將效率提高32%。

· 某試劑CCK-8檢測(cè)體系的靈敏度（低檢出細(xì)胞數(shù)50個(gè)/孔）與線性范圍（R2=0.998）顯著優(yōu)于傳統(tǒng)MTT法。

討論

本研究揭示原代GMCs電轉(zhuǎn)染的電壓-脈沖寬度協(xié)同效應(yīng)：較高電壓（160 V）結(jié)合長(zhǎng)脈沖寬度（25 ms）可增強(qiáng)質(zhì)膜通透性，同時(shí)避免過(guò)度電擊導(dǎo)致的不可逆損傷。威尼德電穿孔儀的多脈沖模式（單次脈沖能量0.8 J）在細(xì)胞膜形成穩(wěn)定微孔，促進(jìn)質(zhì)粒高效內(nèi)化，其能量輸出精度（±0.5%）是維持高存活率的關(guān)鍵。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)，某試劑無(wú)血清電轉(zhuǎn)染緩沖液通過(guò)優(yōu)化離子濃度（K?/Na?比=3:1），顯著降低細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，其成分（如海藻糖）可穩(wěn)定質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，減少核酸酶降解。此外，威尼德成像系統(tǒng)的多光譜熒光采集功能（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm/發(fā)射波長(zhǎng)520 nm）實(shí)現(xiàn)弱信號(hào)的高信噪比檢測(cè)，為長(zhǎng)時(shí)程表達(dá)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)保障。

在應(yīng)用層面，優(yōu)化后的電轉(zhuǎn)染體系成功實(shí)現(xiàn)TGF-β1基因沉默，證明其可用于腎臟纖維化機(jī)制研究。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖與遷移能力的改變，與臨床中GMCs過(guò)度活化表型高度吻合，提示該技術(shù)對(duì)病理模型構(gòu)建及藥物篩選的價(jià)值。

結(jié)論

本研究建立大鼠原代腎小球系膜細(xì)胞高效電轉(zhuǎn)染方案，威尼德電穿孔儀的精準(zhǔn)參數(shù)調(diào)控與某試劑檢測(cè)體系的協(xié)同應(yīng)用，使轉(zhuǎn)染效率突破65%且保持高細(xì)胞活性。該方案為腎臟疾病基因功能研究及靶向治療載體開發(fā)提供標(biāo)準(zhǔn)化工具，顯著提升原代細(xì)胞基因編輯的成功率與可靠性。

參考文獻(xiàn)

 1. 利用電轉(zhuǎn)染技術(shù)對(duì)大鼠原代系膜細(xì)胞進(jìn)行Septin2質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染的研究 [J] . 呂楊 ,李曉帆 ,徐峰 . 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志 . 2011,第4期

2. 自發(fā)性糖尿病小鼠腎小球細(xì)胞Nampt和骨形態(tài)發(fā)生蛋白7的表達(dá)及煙酰胺單核苷酸在高糖條件下對(duì)大鼠腎小球系膜HBZY-1細(xì)胞纖維化的影響 [J] . 陳葉 ,蔡聰捷 ,韋日明 . 中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志 . 2017,第6期

3. Trpc4 在原代培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的定位表達(dá) [J] . 王筱霞 ,姚興梅 ,汪年松 . 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志 . 2010,第12期

4. 大鼠腎小球系膜細(xì)胞原代培養(yǎng)與鑒定 [J] . 羅華 ,桂華珍 ,郭兵 . 貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) . 2006,第2期

5. 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1對(duì)大鼠原代腎小球系膜細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響 [J] . 王德光 ,李學(xué)旺 ,李航 . 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志 . 2006,第7期

6. CD8+T細(xì)胞在腎小球周圍和腎小管間質(zhì)的浸潤(rùn)參與了大鼠系膜增生性腎小球腎炎的疾病進(jìn)展 [C] . 李平 . 第六屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎臟病學(xué)術(shù)會(huì)議 . 2000

7. 高糖對(duì)腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激和增殖的影響及白藜蘆醇的干預(yù)機(jī)制研究&通絡(luò)方劑對(duì)高糖條件下大鼠腎小球系膜細(xì)胞體外增殖作用和氧化應(yīng)激的影響 [A] . 張?zhí)m予 . 2011