摘要

電穿孔技術(shù)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染效率的優(yōu)化效果。通過(guò)調(diào)節(jié)電壓、脈沖時(shí)間等參數(shù)，結(jié)合威尼德電穿孔儀，成功實(shí)現(xiàn)了HEK293和CHO細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)表明，優(yōu)化后的電穿孔條件可顯著提升外源基因表達(dá)水平，同時(shí)維持細(xì)胞存活率。研究結(jié)果為電穿孔技術(shù)在基因功能分析和重組蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了可靠依據(jù)。

引言

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因功能研究和生物醫(yī)藥開(kāi)發(fā)的核心手段之一。傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)染法（如脂質(zhì)體法）雖操作簡(jiǎn)便，但在難轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中效率較低，且易受細(xì)胞類型限制。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)及成本高昂的問(wèn)題。電穿孔技術(shù)通過(guò)瞬時(shí)電脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞膜通透性改變，為基因遞送提供了非化學(xué)、非病毒的替代方案。然而，其效率受脈沖參數(shù)、細(xì)胞狀態(tài)及質(zhì)粒純度等多因素影響，需針對(duì)性優(yōu)化。

本研究以HEK293和CHO細(xì)胞為模型，利用威尼德電穿孔儀系統(tǒng)探索不同電穿孔參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率的調(diào)控規(guī)律，旨在建立適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的高效、低損傷電穿孔轉(zhuǎn)染體系，為基因治療、重組蛋白生產(chǎn)等領(lǐng)域提供技術(shù)支持。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與儀器

細(xì)胞系：HEK293（人胚腎細(xì)胞）、CHO（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞），均于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

質(zhì)粒：攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的pEGFP-N1質(zhì)粒，純度（A260/A280）為1.8-2.0。

主要儀器：威尼德電穿孔儀（參數(shù)范圍：電壓50-500 V，電容100-2500 μF）、威尼德紫外交聯(lián)儀（用于后續(xù)核酸交聯(lián)驗(yàn)證）、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀。

試劑：某試劑細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、某試劑DNA純化試劑盒。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞預(yù)處理

將HEK293和CHO細(xì)胞接種于6孔板，密度為5×10^5 cells/mL，培養(yǎng)24小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

轉(zhuǎn)染前用PBS洗滌兩次，加入0.25%胰酶消化并重懸于電穿孔緩沖液（pH 7.4，含10 mM磷酸鹽、250 mM蔗糖）。

2.2 電穿孔參數(shù)優(yōu)化

電壓梯度測(cè)試：固定電容為1000 μF，脈沖時(shí)間5 ms，測(cè)試電壓范圍（150 V、200 V、250 V）。

脈沖時(shí)間測(cè)試：固定電壓200 V，調(diào)整脈沖時(shí)間（3 ms、5 ms、8 ms）。

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，質(zhì)粒用量為2 μg/10^6 cells。

2.3 轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞存活率檢測(cè)

轉(zhuǎn)染后細(xì)胞接種于含培養(yǎng)基的12孔板，37℃、5% CO?培養(yǎng)48小時(shí)。

熒光顯微鏡觀察：統(tǒng)計(jì)表達(dá)EGFP的細(xì)胞比例。

流式細(xì)胞術(shù)：使用488 nm激光檢測(cè)EGFP陽(yáng)性細(xì)胞占比。

細(xì)胞存活率：采用某試劑細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染法分析。

2.4 外源基因表達(dá)驗(yàn)證

收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用qPCR定量EGFP mRNA表達(dá)量（引物序列：F:5′-GACGACGGCAACTACAAGA-3′，R:5′-CTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′）。

蛋白質(zhì)水平檢測(cè)：Western blot分析EGFP蛋白表達(dá)，一抗為某試劑抗GFP單克隆抗體。

3. 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P<0.05視為差異顯著。

結(jié)果

1. 電穿孔參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響

電壓優(yōu)化：HEK293細(xì)胞在200 V時(shí)轉(zhuǎn)染效率高（62.3±3.1%），CHO細(xì)胞在250 V時(shí)達(dá)峰值（48.7±2.9%）。電壓過(guò)高（>300 V）導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降至<50%。

脈沖時(shí)間：5 ms脈沖下兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均優(yōu)于其他組（HEK293: 65.1±2.8%；CHO: 51.4±3.2%）。

2. 細(xì)胞存活率與轉(zhuǎn)染效率的平衡

HEK293在200 V/5 ms條件下存活率為82.4±4.1%，CHO在250 V/5 ms下存活率為68.9±3.7%。

流式細(xì)胞術(shù)顯示，EGFP陽(yáng)性細(xì)胞群熒光強(qiáng)度較對(duì)照組提升10倍以上。

3. 外源基因表達(dá)驗(yàn)證

qPCR結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后EGFP mRNA表達(dá)量較對(duì)照組增加25-30倍（P<0.001）。

Western blot在約27 kDa處可見(jiàn)清晰EGFP條帶，與預(yù)期分子量一致。

討論

本研究證實(shí)，威尼德電穿孔儀可通過(guò)參數(shù)優(yōu)化顯著提升哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。HEK293因細(xì)胞膜較薄，對(duì)低電壓響應(yīng)更佳，而CHO細(xì)胞需較高電壓以克服膜屏障，此差異可能與細(xì)胞系固有特性相關(guān)。此外，脈沖時(shí)間延長(zhǎng)可增加質(zhì)?？缒茁?，但超過(guò)8 ms可能引發(fā)不可逆膜損傷。實(shí)驗(yàn)建立的優(yōu)化條件在維持細(xì)胞活性的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了外源基因的高效表達(dá)，為后續(xù)大規(guī)模蛋白生產(chǎn)或基因編輯提供了可行方案。

結(jié)論

電穿孔技術(shù)通過(guò)精準(zhǔn)參數(shù)調(diào)控，可高效介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染。本研究利用威尼德電穿孔儀，明確了HEK293與CHO細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件，為基因功能研究與生物制藥開(kāi)發(fā)提供了技術(shù)參考。未來(lái)將進(jìn)一步探索電穿孔與其他遞送技術(shù)（如納米載體）的協(xié)同效應(yīng)，以拓展其在難轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞中的應(yīng)用潛力。

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