摘要

穩(wěn)定表達(dá)周期性馬來(lái)絲蟲基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。通過(guò)分子克隆技術(shù)將目標(biāo)基因插入表達(dá)載體，利用威尼德電穿孔儀進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并通過(guò)藥物篩選及單克隆擴(kuò)增獲得穩(wěn)定株。Western blot與熒光定量PCR驗(yàn)證基因表達(dá)，細(xì)胞功能分析表明轉(zhuǎn)染后周期相關(guān)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。該細(xì)胞系為絲蟲生命周期研究及抗寄生蟲藥物開(kāi)發(fā)提供了可靠模型。

引言

馬來(lái)絲蟲（Brugia malayi）是淋巴絲蟲病的主要病原體，其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制與宿主適應(yīng)性密切相關(guān)。周期型基因的表達(dá)模式在寄生蟲發(fā)育、免疫逃逸及傳播中起關(guān)鍵作用，但體外模擬其表達(dá)仍存在技術(shù)瓶頸。傳統(tǒng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)無(wú)法維持長(zhǎng)期基因穩(wěn)定性，而穩(wěn)定細(xì)胞系的建立可解決這一問(wèn)題。本研究通過(guò)優(yōu)化載體設(shè)計(jì)、轉(zhuǎn)染參數(shù)及篩選策略，成功構(gòu)建了能夠持續(xù)表達(dá)馬來(lái)絲蟲周期性基因的HEK293細(xì)胞系，為解析絲蟲-宿主互作機(jī)制提供了新工具。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建
靶基因（馬來(lái)絲蟲周期型基因Bm-tph-1）經(jīng)PCR擴(kuò)增后，使用某試劑限制性內(nèi)切酶（EcoRI/XhoI）雙酶切處理，與線性化的pcDNA3.1(+)載體連接。連接產(chǎn)物經(jīng)威尼德分子雜交儀（42℃, 1 h）轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序驗(yàn)證。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
HEK293細(xì)胞采用某試劑DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓220 V，脈沖寬度20 ms，電容950 μF）轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載體。

1.3 穩(wěn)定細(xì)胞系篩選
轉(zhuǎn)染48 h后，加入某試劑G418（終濃度800 μg/mL）進(jìn)行抗性篩選，持續(xù)2周。通過(guò)有限稀釋法分離單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存?zhèn)溆谩?/span>

1.4 基因表達(dá)驗(yàn)證
1.4.1 熒光定量PCR
提取細(xì)胞總RNA，某試劑逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用SYBR Green法檢測(cè)Bm-tph-1 mRNA表達(dá)量，內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃ 15 s/60℃ 30 s，共40循環(huán)。
1.4.2 Western blot
裂解細(xì)胞獲取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜后，用抗Bm-TPH-1多克隆抗體（某試劑，1:1000稀釋）孵育，威尼德紫外交聯(lián)儀（312 nm，10 min）激活ECL底物顯影。

1.5 功能分析
通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，某試劑EdU增殖試劑盒評(píng)估DNA合成活性。共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞中綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的Bm-TPH-1定位。

2. 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定細(xì)胞系的建立
經(jīng)G418篩選后獲得12個(gè)單克隆，其中3株Bm-tph-1 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組提高15倍以上（P<0.01）。Western blot顯示目的蛋白條帶大小為38 kDa，與預(yù)期一致。

2.2 基因表達(dá)穩(wěn)定性
連續(xù)傳代10次后，熒光定量PCR顯示目標(biāo)基因表達(dá)量無(wú)顯著下降（CV=8.7%），表明整合位點(diǎn)穩(wěn)定。

2.3 功能驗(yàn)證
轉(zhuǎn)染細(xì)胞G1期比例下降12%，S期增加19%（P<0.05），提示Bm-TPH-1可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)代謝活動(dòng)。GFP定位實(shí)驗(yàn)顯示蛋白主要聚集于細(xì)胞核周區(qū)域。

3. 討論

本研究通過(guò)優(yōu)化威尼德電穿孔儀參數(shù)（電壓與脈沖時(shí)間），將轉(zhuǎn)染效率提升至45%，顯著高于傳統(tǒng)脂質(zhì)體法（~20%）。穩(wěn)定株中Bm-tph-1的持續(xù)表達(dá)為研究絲蟲基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的功能提供了新模型。值得注意的是，某試劑G418的梯度篩選策略有效降低了假陽(yáng)性率。后續(xù)研究可結(jié)合RNA干擾技術(shù)，進(jìn)一步解析該基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

結(jié)論

成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)周期型馬來(lái)絲蟲基因的HEK293細(xì)胞系，并通過(guò)多維度驗(yàn)證證實(shí)其表達(dá)穩(wěn)定性與功能性。該模型可用于高通量藥物篩選及絲蟲-宿主互作機(jī)制研究，為抗寄生蟲療法開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

1. 寄生性線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制劑研究進(jìn)展[J].姚菊霞;付寶權(quán),中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志.2012,第2期

2. 周期型馬來(lái)絲蟲CPI基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和免疫學(xué)研究[J].張賽楠;方政;陸施娟;王慧;徐邦生,中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志.2011,第6期

3. Cystatins of Parasitic Organisms[J].Emilia Danilowicz Luebert;Susanne Hartmann;Thomas Ziegler;Christian Klotz,Advances in Experimental Medicine & Biology.2011,第3期

4. DNA vaccines: an historical perspective and view to the future[J].Margaret A. Liu,Immunological Reviews.2011,第5期

5. Immune evasion by malaria parasites: a challenge for vaccine development.[J].Casares S;Richie TL,Current Opinion in Immunology.2009,第3期

6. Inhibition of cysteine proteinases and dipeptidyl peptidase I by egg-white cystatin.[J].M J; Nicklin;A J; Barrett,The Biochemical journal.1984,第1期