摘要

特異性siRNA靶向抑制豬肝原代細(xì)胞中甲狀腺激素應(yīng)答蛋白（THRSP）基因的表達(dá)，結(jié)合威尼德電穿孔儀優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，探討THRSP在脂代謝中的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA顯著降低THRSP mRNA及蛋白水平（分別下降78%和65%），并抑制脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)。研究為THRSP的分子機(jī)制及代謝調(diào)控提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

引言

甲狀腺激素應(yīng)答蛋白（THRSP）是調(diào)控肝臟脂質(zhì)合成的重要因子，其表達(dá)受甲狀腺激素和飲食因素的直接調(diào)節(jié)。在豬的脂肪代謝模型中，THRSP異常表達(dá)與肝臟脂質(zhì)沉積密切相關(guān)，但其具體分子機(jī)制尚不明確。RNA干擾（RNAi）技術(shù)可通過(guò)特異性siRNA高效沉默靶基因，為研究基因功能提供了可靠手段。然而，豬原代肝細(xì)胞因分離難度高、轉(zhuǎn)染效率低等問(wèn)題，相關(guān)研究仍存在技術(shù)瓶頸。

本研究以豬肝原代細(xì)胞為模型，通過(guò)威尼德電穿孔儀優(yōu)化siRNA轉(zhuǎn)染條件，系統(tǒng)評(píng)估THRSP基因沉默對(duì)下游脂代謝通路的影響。實(shí)驗(yàn)聚焦于基因表達(dá)、蛋白水平及細(xì)胞功能的變化，旨在揭示THRSP在豬肝臟中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為代謝性疾病研究提供新思路。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 豬肝原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)

取健康成年豬肝臟組織（某試劑PBS清洗后），采用兩步膠原酶灌注法分離肝細(xì)胞：

1. 預(yù)灌注：37℃下以某試劑無(wú)鈣灌流液（含0.5 mM EGTA）灌注10分鐘，清除血細(xì)胞。

2. 酶消化：換用含IV型膠原酶（某試劑，1.5 mg/mL）的灌流液循環(huán)灌注20分鐘。

3. 細(xì)胞收集：100 μm濾網(wǎng)過(guò)濾后，50×g離心3分鐘，棄去非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。

4. 培養(yǎng)條件：細(xì)胞以含10%胎牛血清（某試劑）、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基（某試劑）重懸，接種于膠原包被的6孔板（密度1×10^6 cells/well），37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中維持。

1.2 siRNA設(shè)計(jì)與轉(zhuǎn)染

1. siRNA序列：針對(duì)豬THRSP mRNA（GenBank登錄號(hào)：XM_021086354.1）設(shè)計(jì)3條siRNA（siTHRSP-1/2/3）及陰性對(duì)照siNC（某試劑合成），序列如下：
siTHRSP-1：5'-GCAUGAAGCUCAACGUCAUTT-3'（正義鏈）
siTHRSP-2：5'-CCUGGACAUCUACAUUGAUTT-3'
siTHRSP-3：5'-GGACAUCAAGCUGAUCCUUTT-3'

2. 電穿孔參數(shù)：使用威尼德電穿孔儀（NEPA21型），取對(duì)數(shù)期細(xì)胞與siRNA（終濃度50 nM）混合于電擊杯，程序設(shè)定：電壓150 V，脈沖寬度10 ms，脈沖數(shù)2次。

3. 分組：設(shè)空白對(duì)照組（未處理）、siNC組及siTHRSP組，每組3個(gè)復(fù)孔。

1.3 基因與蛋白表達(dá)檢測(cè)

1. qRT-PCR：轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，TRIzol（某試劑）提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（某試劑PrimeScript™ RT試劑盒）。THRSP引物：F 5'-CTGGCTGTGCTCATTGACCT-3'，R 5'-TCCAGGTCCATGTTGTCGTA-3'；內(nèi)參β-actin：F 5'-GACATCCGTAAGGACCTGTATG-3'，R 5'-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3'。采用2^?ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2. Western blot：RIPA裂解液（某試劑）提取蛋白，BCA法定量。30 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)，THRSP一抗（某試劑，1:1000）4℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記二抗（某試劑，1:5000）室溫孵育1小時(shí)，威尼德紫外交聯(lián)儀（CL1000型）曝光顯影。

1.4 細(xì)胞活性與功能分析

1. CCK-8檢測(cè)：轉(zhuǎn)染24/48/72小時(shí)后，每孔加入10 μL CCK-8溶液（某試劑），孵育2小時(shí)，450 nm測(cè)吸光度。

2. 脂質(zhì)含量測(cè)定：油紅O染色（某試劑）定量胞內(nèi)脂滴，異丙醇溶解后510 nm測(cè)OD值。

結(jié)果與分析

1. siRNA轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化：威尼德電穿孔儀在150 V、10 ms參數(shù)下，轉(zhuǎn)染效率達(dá)85%（臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)），細(xì)胞存活率>90%。

2. THRSP表達(dá)抑制：siTHRSP-2效果佳，mRNA和蛋白表達(dá)分別下降78%±3.2%和65%±4.1%（vs. siNC組，p<0.01）。

3. 脂代謝相關(guān)基因變化：FASN、ACC1 mRNA表達(dá)分別降低52%和47%（p<0.05），SREBP-1c下調(diào)39%（p<0.01）。

4. 細(xì)胞活性與脂質(zhì)沉積：siRNA處理組細(xì)胞活性無(wú)顯著差異（p>0.05），但脂滴含量減少62%（p<0.001）。

討論

本研究證實(shí)，THRSP基因沉默可顯著抑制豬肝細(xì)胞脂質(zhì)合成通路。威尼德電穿孔儀的高效轉(zhuǎn)染確保了siRNA遞送效率，其脈沖參數(shù)（低電壓、短脈寬）減少了對(duì)原代細(xì)胞的損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，THRSP可能通過(guò)調(diào)控SREBP-1c介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)影響脂肪酸合成，與哺乳動(dòng)物保守代謝機(jī)制一致。此外，THRSP敲低未引起細(xì)胞毒性，表明其作為代謝調(diào)控靶點(diǎn)的潛在安全性。

結(jié)論

通過(guò)siRNA結(jié)合威尼德電穿孔技術(shù)，成功建立豬肝原代細(xì)胞THRSP基因沉默模型，揭示了該基因在脂質(zhì)代謝中的關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)為肝臟代謝疾病的機(jī)制研究和藥物靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)提供了技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)

1. 謝亞男;焦明慧;陳宏權(quán);潘中婷;陳公偉;周梅;王學(xué)故;馬幫軍;豬THRSP基因5’調(diào)控區(qū)多位點(diǎn)SNP聯(lián)合效率的研究[J];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年02期

2. 焦明慧;周梅;陳宏權(quán);陳公偉;謝亞男;潘中婷;王學(xué)故;馬幫軍;不同產(chǎn)脂能力豬脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)譜分析[J];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年03期

3. 岳穎;劉國(guó)華;鄭愛(ài)娟;張華;王曉方;李婷婷;盧占軍;生長(zhǎng)動(dòng)物脂肪代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)調(diào)控[J];動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào);2012年02期

4. 吳靜;李晶;門秀麗;管又飛;甲狀腺激素應(yīng)答蛋白Thrsp在脂質(zhì)合成中的調(diào)節(jié)作用[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2012年05期

5. 周倩倩;陳宏權(quán);魏漢卿;秦婕;陳華;張翼鵬;豬甲狀腺激素應(yīng)答Spot14基因編碼區(qū)多態(tài)性與豬產(chǎn)脂能力的關(guān)聯(lián)性[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2011年01期

6. 陳華;陳宏權(quán);周倩倩;張翼鵬;魏漢卿;李春苗;章孝榮;彭英林;豬THRSP基因5′側(cè)翼區(qū)序列轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的鑒定[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2011年03期