摘要

通過威尼德電穿孔儀優(yōu)化轉(zhuǎn)染參數(shù)，實(shí)現(xiàn)外源基因高效導(dǎo)入大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電穿孔電壓260 V、脈沖時(shí)長(zhǎng)5 ms時(shí)轉(zhuǎn)染效率達(dá)68.5%，細(xì)胞存活率>80%。Western blot證實(shí)目的蛋白穩(wěn)定表達(dá)，表明該方法具有可行性，為肌肉再生研究提供技術(shù)支持。

引言

骨骼肌損傷修復(fù)依賴肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖與分化能力，而基因編輯技術(shù)是調(diào)控其功能的重要手段。傳統(tǒng)化學(xué)轉(zhuǎn)染法存在效率低、細(xì)胞毒性強(qiáng)等問題，病毒載體則伴隨生物安全風(fēng)險(xiǎn)。電穿孔技術(shù)通過瞬時(shí)電場(chǎng)改變細(xì)胞膜通透性，具有操作簡(jiǎn)便、適用范圍廣的特點(diǎn)，但其在肌衛(wèi)星細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染參數(shù)尚未系統(tǒng)優(yōu)化。

研究以原代大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞為模型，利用威尼德電穿孔儀探索最佳轉(zhuǎn)染條件，結(jié)合分子生物學(xué)手段驗(yàn)證外源基因表達(dá)效率，為后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1. 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

取8周齡SD大鼠后肢骨骼肌，經(jīng)膠原酶/分散酶（某試劑）消化后，采用差速貼壁法純化肌衛(wèi)星細(xì)胞。細(xì)胞接種于含15%胎牛血清（某試劑）、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO?條件下擴(kuò)增至第3代用于實(shí)驗(yàn)。

2. 質(zhì)粒構(gòu)建與驗(yàn)證

采用pEGFP-N1質(zhì)粒（某試劑）作為報(bào)告基因載體，經(jīng)威尼德紫外交聯(lián)儀（紫外線強(qiáng)度3000 μJ/cm2）進(jìn)行線性化處理。通過1%瓊脂糖凝膠電泳及Nanodrop（某試劑）檢測(cè)質(zhì)粒濃度與純度（A260/A280=1.8-2.0）。

3. 電穿孔參數(shù)優(yōu)化

將1×10?細(xì)胞與10 μg質(zhì)粒混合于電轉(zhuǎn)杯，使用威尼德電穿孔儀進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)：

電壓組：200 V、240 V、260 V、280 V

脈沖時(shí)長(zhǎng)組：3 ms、5 ms、7 ms

脈沖次數(shù)：單次與雙次脈沖對(duì)比

轉(zhuǎn)染后細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移至預(yù)溫培養(yǎng)基，24 h后觀察熒光表達(dá)。

4. 檢測(cè)方法

流式細(xì)胞術(shù)：收集轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，使用BD FACSCalibur分析EGFP陽性率。

細(xì)胞活性檢測(cè)：CCK-8試劑（某試劑）測(cè)定轉(zhuǎn)染后24 h、48 h存活率。

Western blot：RIPA裂解液（某試劑）提取總蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，Anti-GFP抗體（某試劑）檢測(cè)目的蛋白表達(dá)。

結(jié)果

1. 參數(shù)優(yōu)化結(jié)果
260 V/5 ms單脈沖條件下，流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率達(dá)68.5±3.2%，顯著高于其他組（P<0.01）。雙脈沖雖可提升至72.1%，但細(xì)胞存活率降至68.3%。280 V組出現(xiàn)明顯細(xì)胞聚集死亡現(xiàn)象。

2. 細(xì)胞活性分析
CCK-8結(jié)果顯示，260 V組轉(zhuǎn)染后24 h存活率為82.4±2.1%，48 h恢復(fù)至89.7%，表明電穿孔引起的膜損傷可快速修復(fù)。

3. 蛋白表達(dá)驗(yàn)證
Western blot在48 h樣本中檢測(cè)到28 kDa清晰條帶，灰度分析顯示表達(dá)量隨時(shí)間遞增，72 h達(dá)到峰值。免疫熒光顯示EGFP均勻分布于細(xì)胞質(zhì)，核周區(qū)域富集。

討論

本研究系統(tǒng)闡明電穿孔參數(shù)對(duì)大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響機(jī)制：260 V電場(chǎng)強(qiáng)度可有效克服肌細(xì)胞膜高電阻特性，而5 ms脈沖時(shí)長(zhǎng)平衡了質(zhì)粒導(dǎo)入與膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（效率<30%）相比，電穿孔顯著提升外源基因表達(dá)量，且避免殘留載體干擾。值得注意的是，肌衛(wèi)星細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)膜膽固醇含量較高，可能影響電穿孔效率，后續(xù)研究可聯(lián)合去膽固醇預(yù)處理進(jìn)一步優(yōu)化。

結(jié)論

威尼德電穿孔儀在260 V/5 ms參數(shù)下可實(shí)現(xiàn)大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞高效、低損傷轉(zhuǎn)染，EGFP表達(dá)穩(wěn)定持續(xù)72 h以上。該方法克服了肌肉細(xì)胞轉(zhuǎn)染難題，為基因治療肌肉性疾病提供了可靠技術(shù)路徑。

參考文獻(xiàn)

1. 人體肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[J].黃漢偉;徐建光;顧玉東;李繼峰;胡韶楠,中國修復(fù)重建外科雜志.2001,第5期

2. Adeno-associated virus-mediated transduction of VEGF165 improves cardiac tissue viability and functional recovery after permanent coronary occlusion in conscious dogs.[J].Matteo; Ferrarini;Nikola; Arsic;Fabio A; Recchia;Lorena; Zentilin;Serena; Zacchigna;Xiaobin; Xu;Axel; Linke;Mauro; Giacca;Thomas H; Hintze,Circulation research.2006,第7期

3. Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up.[J].Onderwater EE;Lee CH;Serruys PW;van Geuns RJ;Smits PC;Bountioukos M;Maat AP;Poldermans D,Journal of the American College of Cardiology.2003,第12期

4. Cell-based therapy for heart failure.[J].Drexler H;Wollert KC,Current opinion in cardiology.2006,第3期

5. Current state of the art in myocardial tissue engineering.[J].Giraud MN;Armbruster C;Carrel T;Tevaearai HT,Tissue engineering.2007,第8期

6. Electric pulses applied prior to intramuscular DNA vaccination greatly improve the vaccine immunogenicity[J].Zhao Y;Peng B;Xu Y;Xu L,Vaccine.2007,第11期