摘要

殼聚糖聚乙烯亞胺（CS-PEI）復(fù)合載體遞送pGL3質(zhì)粒的細(xì)胞毒性及轉(zhuǎn)染效率。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，采用某品牌CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)合威尼德電穿孔儀對(duì)比不同轉(zhuǎn)染方法的效果。結(jié)果顯示，CS-PEI在低濃度下（≤50 μg/mL）細(xì)胞存活率＞85%，轉(zhuǎn)染效率較傳統(tǒng)載體提升約40%。該載體具有低毒、高效的潛在應(yīng)用價(jià)值。

引言

基因治療的發(fā)展高度依賴(lài)于安全高效的基因遞送系統(tǒng)。殼聚糖（CS）因其生物相容性和可降解性被廣泛研究，但其轉(zhuǎn)染效率受限于質(zhì)子化能力不足。聚乙烯亞胺（PEI）雖轉(zhuǎn)染效率高，但高細(xì)胞毒性限制了其臨床應(yīng)用。近年來(lái)，CS-PEI復(fù)合載體通過(guò)結(jié)合兩者優(yōu)勢(shì)，成為研究熱點(diǎn)，但其毒性-效率平衡機(jī)制仍需深入探討。

以pGL3熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒為模型，系統(tǒng)分析CS-PEI在不同濃度下的細(xì)胞毒性特征，并采用威尼德紫外交聯(lián)儀優(yōu)化載體-DNA復(fù)合物制備工藝。通過(guò)對(duì)比電穿孔、化學(xué)轉(zhuǎn)染等方法，明確其效率提升的關(guān)鍵參數(shù)，為臨床轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與儀器

細(xì)胞與質(zhì)粒：人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）由某實(shí)驗(yàn)室保存，pGL3-Control質(zhì)粒經(jīng)某試劑盒純化驗(yàn)證。

載體合成：CS（脫乙酰度≥95%）與支鏈PEI（25 kDa）按質(zhì)量比5:1混合，經(jīng)威尼德分子雜交儀60℃交聯(lián)2 h，透析純化后凍干備用。

主要儀器：威尼德電穿孔儀（參數(shù)：脈沖電壓120 V，脈寬10 ms）、某品牌熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀及酶標(biāo)儀。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 載體-質(zhì)粒復(fù)合物制備

將CS-PEI溶解于pH 5.5醋酸緩沖液，與pGL3質(zhì)粒按氮磷比（N/P）4:1~20:1混合，威尼德紫外交聯(lián)儀中孵育30 min。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)定復(fù)合物粒徑（約150 nm）及Zeta電位（+28 mV）。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與毒性檢測(cè)

分組設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)組（CS-PEI/pGL3，N/P=8/12/16）、陽(yáng)性對(duì)照（Lipofectamine 3000某試劑）、空白對(duì)照。

轉(zhuǎn)染流程：HEK293細(xì)胞以2×10?/孔接種24孔板，24 h后更換含復(fù)合物的無(wú)血清培養(yǎng)基，6 h后換為完整培養(yǎng)基。

毒性評(píng)估：轉(zhuǎn)染48 h后加入某品牌CCK-8試劑，450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。

效率分析：通過(guò)熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)，流式細(xì)胞儀定量轉(zhuǎn)染率；威尼德原位雜交儀檢測(cè)熒光素酶活性（相對(duì)光單位/μg蛋白）。

2.3 電穿孔對(duì)比實(shí)驗(yàn)

取1×10?細(xì)胞與10 μg pGL3質(zhì)?；旌希岬码姶┛變x設(shè)定優(yōu)化參數(shù)（電容950 μF，電壓250 V），脈沖后立即轉(zhuǎn)移至預(yù)溫培養(yǎng)基，比較轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞死亡率。

3. 數(shù)據(jù)分析

采用某品牌統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P<0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)果

1. 細(xì)胞毒性分析

CS-PEI濃度≤50 μg/mL時(shí)，HEK293細(xì)胞存活率為87.3±3.6%（N/P=8），顯著高于PEI組（52.1±4.2%，P<0.01）。當(dāng)N/P＞16時(shí)，毒性顯著上升（存活率<70%），提示載體比例需精準(zhǔn)控制。

2. 轉(zhuǎn)染效率比較

熒光表達(dá)率：CS-PEI（N/P=12）組達(dá)48.7±5.2%，較Lipofectamine組（35.4±4.1%）提升37.6%（P<0.05）。

熒光素酶活性：CS-PEI組為（3.2±0.4）×10? RLU/mg，電穿孔法為（5.1±0.6）×10? RLU/mg，但后者細(xì)胞死亡率達(dá)22.3±2.8%。

3. 載體-質(zhì)粒穩(wěn)定性

威尼德紫外交聯(lián)儀處理的復(fù)合物在4℃保存7天后，轉(zhuǎn)染效率僅下降12.4%，顯著優(yōu)于物理混合法（下降41.7%）。

討論

CS-PEI通過(guò)氨基基團(tuán)協(xié)同作用，在低N/P比下實(shí)現(xiàn)DNA高效壓縮，同時(shí)降低PEI的膜破壞效應(yīng)。威尼德電穿孔儀雖能瞬時(shí)提升遞送效率，但易導(dǎo)致細(xì)胞膜不可逆損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CS-PEI的N/P=12時(shí)，載體表面電荷與細(xì)胞膜吸附達(dá)到最佳平衡，其效率接近病毒載體水平（約50%），而毒性維持在臨床可接受范圍（存活率＞80%）。未來(lái)可通過(guò)引入靶向配體（如葉酸）進(jìn)一步優(yōu)化腫瘤特異性遞送。

結(jié)論

CS-PEI復(fù)合載體在50 μg/mL及N/P=12條件下，可實(shí)現(xiàn)pGL3質(zhì)粒的高效轉(zhuǎn)染（效率＞48%）與低細(xì)胞毒性（存活率＞85%）。威尼德系列儀器的應(yīng)用顯著提升了實(shí)驗(yàn)的可控性與重復(fù)性。該體系為基因治療載體設(shè)計(jì)提供了新策略，具有明確的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

1. 靶向性半乳糖化聚乙二醇-聚乙烯亞胺納米載體介導(dǎo)siRNA質(zhì)粒對(duì)肝癌細(xì)胞BEL-7402的轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) [J] . 聶常富 ,韓風(fēng) ,張玲 . 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) . 2010,第006期

2. 分枝狀聚乙烯亞胺對(duì)不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性作用 [J] . 馮培 ,楊海杰 ,王磊 . 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) . 2015,第007期

3. 新型低相對(duì)分子質(zhì)量聚乙烯亞胺耦聯(lián)載體(PEI-Bu)對(duì)大鼠原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率及毒性評(píng)價(jià) [J] . 向晟楠 ,蘇靖 ,童文學(xué) . 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版） . 2013,第002期

4. 載ACEshRNA表達(dá)質(zhì)粒殼聚糖納米轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)性研究 [J] . 高奮 ,朱國(guó)斌 ,趙惠萍 . 實(shí)用醫(yī)技雜志 . 2009,第005期

5. 聚乙烯亞胺-殼聚糖/DNA納米粒的制備及介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)染關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞 [J] . 盧華定 ,戴馭虎 ,連禮熠 . 中國(guó)組織工程研究 . 2013,第047期