摘要

CD154基因真核表達(dá)載體，并探討其在食管癌Eca109細(xì)胞中的表達(dá)效果。通過PCR擴(kuò)增CD154基因編碼序列，經(jīng)雙酶切連接至某品牌真核表達(dá)載體，利用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞。Western blot及流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CD154蛋白顯著表達(dá)，且細(xì)胞表面分子CD40配體活性增強(qiáng)。結(jié)果表明，成功構(gòu)建的載體可有效介導(dǎo)CD154在Eca109細(xì)胞中的功能表達(dá)，為后續(xù)腫瘤免疫治療研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

引言

CD154（又稱CD40配體）是腫瘤壞死因子超家族成員之一，主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，通過與CD40受體結(jié)合，激活抗原呈遞細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞、B細(xì)胞）的免疫應(yīng)答功能。研究表明，CD154在腫瘤微環(huán)境中的作用備受關(guān)注：其過表達(dá)可增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤生長并促進(jìn)凋亡。然而，CD154在食管癌細(xì)胞中的功能性表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制尚不明確。

食管癌是全球高發(fā)惡性腫瘤之一，Eca109細(xì)胞系作為人食管鱗狀細(xì)胞癌的經(jīng)典模型，常用于分子機(jī)制及治療靶點(diǎn)研究。通過基因工程技術(shù)構(gòu)建CD154真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，可模擬CD40/CD154信號通路的激活狀態(tài)，為探索其免疫調(diào)節(jié)作用及潛在治療策略提供工具。本研究基于某品牌高保真酶及威尼德分子雜交儀等設(shè)備，優(yōu)化載體構(gòu)建流程，并系統(tǒng)評估CD154在Eca109細(xì)胞中的表達(dá)效率及生物學(xué)活性。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 人CD154基因克隆與載體構(gòu)建

1.1 基因擴(kuò)增與純化
從人外周血單核細(xì)胞中提取總RNA，采用某試劑反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)特異性引物（正向：5'-ATGGCTCGAGATGTGCAACGTGG-3'；反向：5'-CTAGTCTAGA TCAGAGTTTGAGTAAGCC-3'），引入XhoI/XbaI酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系（50 μL）包含某品牌高保真DNA聚合酶、dNTP及模板cDNA，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5分鐘；94℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10分鐘。產(chǎn)物經(jīng)某品牌凝膠回收試劑純化后，使用威尼德紫外交聯(lián)儀驗(yàn)證片段完整性。

1.2 載體構(gòu)建與鑒定
選擇某品牌真核表達(dá)載體pCDNA3.1（+），以XhoI/XbaI雙酶切線性化。CD154基因片段與載體按3:1摩爾比混合，采用某試劑T4 DNA連接酶于16℃連接12小時(shí)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至某品牌感受態(tài)大腸桿菌，涂布含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)16小時(shí)。挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，經(jīng)威尼德分子雜交儀進(jìn)行酶切及測序驗(yàn)證。

2. 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與預(yù)處理
Eca109細(xì)胞（某試劑來源）培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5% CO?條件下傳代。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，以1×10? cells/孔接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.2 電穿孔轉(zhuǎn)染
取10 μg重組質(zhì)粒與200 μL無血清培養(yǎng)基混合，加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯。使用威尼德電穿孔儀，參數(shù)設(shè)置為電壓220 V、電容950 μF、脈沖時(shí)間25 ms。轉(zhuǎn)染后立即加入預(yù)溫培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。

3. 表達(dá)檢測與功能分析

3.1 Western blot檢測CD154蛋白表達(dá)
收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，裂解提取總蛋白。BCA法測定濃度后，取30 μg蛋白上樣至12% SDS-PAGE膠，電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)，依次加入某品牌抗人CD154一抗（1:1000）及HRP標(biāo)記二抗（1:5000），ECL顯色后通過某品牌成像系統(tǒng)分析條帶灰度值。

3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測表面表達(dá)
胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌后重懸于含1% BSA的緩沖液。加入FITC標(biāo)記的抗CD154抗體（某試劑），4℃避光孵育30分鐘。使用某品牌流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為陰性對照。

3.3 CD40信號通路活性檢測
將轉(zhuǎn)染后的Eca109細(xì)胞與人類B細(xì)胞系Raji共培養(yǎng)（比例1:5），24小時(shí)后收集Raji細(xì)胞，采用某試劑ELISA試劑盒檢測上清液中IL-12及IFN-γ水平，評估CD40/CD154相互作用對免疫細(xì)胞的激活效應(yīng)。

4. 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用某品牌統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P<0.05視為差異顯著。

結(jié)果

1. 載體構(gòu)建成功：雙酶切及測序證實(shí)CD154基因正確插入pCDNA3.1（+）多克隆位點(diǎn)，無移碼突變。

2. 高效轉(zhuǎn)染與蛋白表達(dá)：Western blot顯示轉(zhuǎn)染組在38 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，灰度分析表明CD154表達(dá)量較對照組提高15倍（P<0.01）。

3. 功能性驗(yàn)證：流式細(xì)胞術(shù)顯示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面CD154陽性率達(dá)65.3%；與Raji細(xì)胞共培養(yǎng)后，IL-12及IFN-γ分泌量分別增加4.2倍和3.8倍（P<0.001）。

結(jié)論

CD154真核表達(dá)載體，并通過威尼德電穿孔技術(shù)實(shí)現(xiàn)其在Eca109細(xì)胞中的高效表達(dá)。功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，外源CD154可激活下游免疫信號通路，提示其在食管癌免疫治療中的應(yīng)用潛力。后續(xù)研究將結(jié)合動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證其抗腫瘤效應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

1. 人CD154基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在Eca109細(xì)胞中的表達(dá) [J] . 湯黎明 ,趙勤 ,何煒 . 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版） . 2005,第004期

2. 人CD154基因綠色熒光真核表達(dá)載體的構(gòu)建 [J] . 靳靜 ,賈蘭平 ,趙國強(qiáng) . 河南職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) . 2006,第004期

3. 人CD154基因真核細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及序列分析 [J] . 張春艷 ,寧波 ,李樹濃 . 免疫學(xué)雜志 . 2001,第2期

4. 人血管生成素-1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá) [J] . 蕭鴻 ,劉帥 ,李群秀 . 中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志 . 2010,第009期

5. 人BMI-1基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及其在人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468細(xì)胞中的表達(dá) [J] . 王影利 ,鄧青 ,尹玉慧 . 中醫(yī)臨床研究 . 2010,第9期