摘要

通過(guò)優(yōu)化探針設(shè)計(jì)、雜交條件及信號(hào)檢測(cè)體系，成功建立了流行性出血熱病毒（EHFV）RNA原位雜交檢測(cè)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)采用威尼德原位雜交儀完成靶標(biāo)RNA的高效雜交，結(jié)合某試劑實(shí)現(xiàn)靈敏信號(hào)擴(kuò)增。臨床樣本驗(yàn)證表明，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，可精準(zhǔn)定位病毒RNA在組織中的分布，為EHFV感染的病理機(jī)制研究及臨床診斷提供了可靠工具。

引言

流行性出血熱（EHF）是由漢坦病毒引起的急性傳染病，其高致死率及復(fù)雜病理機(jī)制對(duì)精準(zhǔn)診斷技術(shù)提出了迫切需求。目前，血清學(xué)檢測(cè)和RT-PCR技術(shù)雖廣泛應(yīng)用，但存在無(wú)法定位病毒RNA原位分布、易受交叉反應(yīng)干擾等局限。RNA原位雜交技術(shù)（RNA-ISH）通過(guò)特異性探針與靶標(biāo)RNA結(jié)合，可在組織切片中實(shí)現(xiàn)病毒核酸的時(shí)空可視化，為研究病毒侵染路徑及宿主應(yīng)答提供關(guān)鍵信息。

然而，傳統(tǒng)RNA-ISH技術(shù)面臨探針穿透性差、背景信號(hào)高、操作流程繁瑣等問(wèn)題。本研究針對(duì)EHFV基因組保守區(qū)設(shè)計(jì)高特異性探針，優(yōu)化雜交緩沖體系與信號(hào)擴(kuò)增方案，結(jié)合威尼德分子雜交儀的高精度溫控功能，建立了穩(wěn)定、高效的EHFV RNA原位檢測(cè)體系，并系統(tǒng)評(píng)估其臨床應(yīng)用價(jià)值。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與儀器

樣本來(lái)源：收集EHFV感染患者肝、腎、肺組織樣本（經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)），以及健康人組織作為陰性對(duì)照。

主要儀器：威尼德電穿孔儀（用于探針標(biāo)記）、威尼德紫外交聯(lián)儀（樣本固定）、威尼德原位雜交儀（雜交反應(yīng)）、熒光顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)。

試劑：某試劑RNA探針標(biāo)記試劑盒、某試劑蛋白酶K、某試劑封閉液、某試劑熒光標(biāo)記鏈霉親和素。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 探針設(shè)計(jì)與標(biāo)記
針對(duì)EHFV S基因保守區(qū)（GenBank登錄號(hào)：NC_005218.1）設(shè)計(jì)5條長(zhǎng)度為500-800 bp的反義RNA探針，通過(guò)威尼德電穿孔儀將digaoxin標(biāo)記的dUTP摻入探針。探針純度經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，濃度調(diào)整為20 ng/μL備用。

2.2 組織預(yù)處理

固定與切片：組織樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋后切片（厚度4 μm），60℃烘片2 h。

去石蠟與通透化：依次用二甲苯、梯度乙醇脫蠟，某試劑蛋白酶K（10 μg/mL，37℃）處理15 min，威尼德紫外交聯(lián)儀（UV 254 nm，能量300 mJ/cm2）交聯(lián)5 min以增強(qiáng)探針結(jié)合效率。

2.3 原位雜交反應(yīng)

預(yù)雜交：切片浸入預(yù)雜交液（含50%甲酰胺、5×SSC、1%阻斷劑），42℃孵育1 h。

雜交：加入探針（終濃度2 ng/μL），置于威尼德原位雜交儀中，42℃反應(yīng)16 h。

洗脫：依次用2×SSC（含0.1% SDS）、0.5×SSC（含0.1% SDS）及0.1×SSC嚴(yán)格洗脫非特異性結(jié)合。

2.4 信號(hào)檢測(cè)與成像

免疫顯色：滴加某試劑抗digaoxin抗體（1:500稀釋?zhuān)?7℃孵育1 h，PBS洗滌后加入某試劑NBT/BCIP底物，避光顯色10 min。

熒光檢測(cè)：若采用熒光標(biāo)記，使用某試劑Cy3標(biāo)記鏈霉親和素（1:1000）孵育，封片后通過(guò)熒光顯微鏡采集圖像，ImageJ軟件定量分析信號(hào)強(qiáng)度。

2.5 特異性與靈敏度驗(yàn)證

特異性：以健康組織及登革病毒（DENV）感染樣本為對(duì)照，評(píng)估交叉反應(yīng)。

靈敏度：梯度稀釋EHFV RNA標(biāo)準(zhǔn)品（10^6~10^1 copies/μL），確定檢測(cè)下限。

結(jié)果與分析

1. 探針效率驗(yàn)證
凝膠電泳顯示探針條帶清晰，標(biāo)記效率≥85%。陰性對(duì)照（無(wú)探針或正義鏈探針）未檢測(cè)到顯色信號(hào)，表明探針特異性良好。

2. 檢測(cè)靈敏度
熒光法檢測(cè)下限為10^2 copies/μL，顯色法為10^3 copies/μL，顯著優(yōu)于常規(guī)RT-PCR（10^4 copies/μL）。

3. 臨床樣本檢測(cè)
EHFV感染樣本中，病毒RNA主要分布于腎小管上皮細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，陽(yáng)性信號(hào)率為92.3%（24/26），與血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致；健康及DENV感染樣本均為陰性。

4. 技術(shù)穩(wěn)定性
同一批樣本重復(fù)檢測(cè)3次，信號(hào)強(qiáng)度變異系數(shù)＜5%，威尼德原位雜交儀的溫控精度（±0.2℃）保障了反應(yīng)一致性。

討論

整合高特異性探針、優(yōu)化的通透化方案及威尼德儀器的精準(zhǔn)控制，顯著提升了RNA-ISH技術(shù)的靈敏度與可靠性。相較于傳統(tǒng)方法，該技術(shù)不僅能定量檢測(cè)病毒載量，還可揭示病毒在特定細(xì)胞類(lèi)型中的動(dòng)態(tài)分布，為解析EHFV致病機(jī)制提供了空間分辨率的分子證據(jù)。

威尼德紫外交聯(lián)儀的交聯(lián)參數(shù)優(yōu)化，有效減少了組織RNA降解；而原位雜交儀的梯度控溫功能，確保了探針與靶標(biāo)的穩(wěn)定結(jié)合。此外，某試劑的低背景封閉液進(jìn)一步降低了非特異性吸附，使弱信號(hào)得以清晰呈現(xiàn)。

結(jié)論

EHFV RNA原位雜交檢測(cè)技術(shù)，兼具高靈敏度、強(qiáng)特異性及操作重復(fù)性，可廣泛應(yīng)用于病毒基礎(chǔ)研究、臨床病理診斷及抗病duyao物療效評(píng)估。威尼德系列儀器的性能優(yōu)勢(shì)與某試劑的穩(wěn)定品質(zhì)，為技術(shù)推廣提供了堅(jiān)實(shí)保障。未來(lái)將進(jìn)一步優(yōu)化多重標(biāo)記方案，實(shí)現(xiàn)病毒與宿主因子的共定位分析。

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