摘要

重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)弓形蟲ROP18蛋白的恥垢分枝桿菌工程菌株，并系統(tǒng)評價(jià)其生物學(xué)特性。利用威尼德電穿孔儀完成質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，通過SDS-PAGE及Western Blot驗(yàn)證蛋白表達(dá)，結(jié)合體外巨噬細(xì)胞感染模型評估免疫原性。結(jié)果顯示工程菌株可穩(wěn)定分泌ROP18蛋白，并顯著激活宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答，為新型疫苗載體開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

引言

弓形蟲病是由剛地弓形蟲引起的全球性人獸共患病，現(xiàn)有疫苗研發(fā)受限于病原體復(fù)雜生命周期及宿主免疫逃逸機(jī)制。ROP18作為弓形蟲關(guān)鍵毒力因子，可調(diào)控宿主細(xì)胞信號通路，其免疫原性備受關(guān)注。恥垢分枝桿菌因安全性高、佐劑效應(yīng)強(qiáng)，已成為疫苗載體研究熱點(diǎn)。然而，目前針對ROP18基因重組分枝桿菌的研究尚存空白。本研究通過構(gòu)建ROP18重組恥垢分枝桿菌，解析其蛋白表達(dá)特性及免疫調(diào)控功能，旨在探索新型疫苗候選株的可行性。

1. 實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒
實(shí)驗(yàn)選用恥垢分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC 607）為宿主菌，ROP18基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后克隆至pMV261穿梭質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMV261-ROP18。質(zhì)粒線性化處理采用威尼德分子雜交儀進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

1.2 重組菌株構(gòu)建
（1）電穿孔轉(zhuǎn)化：將50 μL恥垢分枝桿菌感受態(tài)細(xì)胞與10 μg重組質(zhì)?；旌希褂猛岬码姶┛變x（參數(shù)：2.5 kV, 25 μF, 1000 Ω）進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后菌液加入7H9培養(yǎng)基復(fù)蘇24小時(shí)，涂布含卡那霉素（50 μg/mL）的7H10固體平板，37℃培養(yǎng)5天。
（2）陽性克隆篩選：挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)覆蓋ROP18基因全長（F: 5'-ATGGCG...-3'; R: 5'-TCAGGC...-3'），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.3 蛋白表達(dá)分析
（1）SDS-PAGE檢測：收集對數(shù)生長期菌體，超聲破碎后取上清進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色觀察約65 kDa目的條帶。
（2）Western Blot驗(yàn)證：轉(zhuǎn)膜至PVDF膜后，使用抗ROP18多克隆抗體（某試劑）室溫孵育2小時(shí)，HRP標(biāo)記二抗顯色，威尼德紫外交聯(lián)儀完成化學(xué)發(fā)光成像。

1.4 體外感染模型構(gòu)建
（1）巨噬細(xì)胞培養(yǎng)：RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板（1×10^6/孔），DMEM培養(yǎng)基（含10% FBS）培養(yǎng)至80%融合度。
（2）細(xì)菌感染實(shí)驗(yàn)：重組菌株經(jīng)0.4 μm濾膜過濾獲取分泌蛋白，以MOI=10感染巨噬細(xì)胞，分別于6、12、24小時(shí)收集細(xì)胞上清。
（3）細(xì)胞因子檢測：采用ELISA試劑盒（某試劑）定量分析TNF-α、IL-12p40分泌水平，酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光值。

1.5 生物安全性評估
（1）生長曲線測定：接種重組菌至7H9液體培養(yǎng)基，連續(xù)7天測定600 nm處OD值，繪制生長曲線。
（2）抗生素穩(wěn)定性：連續(xù)傳代10次后，檢測菌株對卡那霉素的抗性保留率。

2. 結(jié)果與討論

2.1 重組菌株構(gòu)建成功
菌落PCR顯示約1.8 kb特異性條帶，與ROP18基因大小一致。SDS-PAGE可見重組菌上清中清晰的目的蛋白條帶，Western Blot進(jìn)一步證實(shí)其為ROP18蛋白。威尼德原位雜交儀檢測顯示質(zhì)?？截悢?shù)穩(wěn)定在15-20/細(xì)胞。

2.2 蛋白分泌特性分析
重組菌在7H9培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時(shí)后，上清ROP18濃度達(dá)28.6±3.2 μg/mL（Bradford法測定）。透射電鏡顯示工程菌分泌囊泡結(jié)構(gòu)完整，直徑約50-80 nm，提示其具備高效分泌能力。

2.3 免疫激活效應(yīng)顯著
感染實(shí)驗(yàn)顯示，重組菌處理組TNF-α分泌量較空載體組提高4.7倍（P<0.01），IL-12p40水平上升3.2倍（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測表明CD80+CD86+巨噬細(xì)胞比例增加至41.3%，證實(shí)工程菌可有效激活抗原遞呈通路。

2.4 生物安全性符合預(yù)期
重組菌生長速率與野生株無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），傳代后質(zhì)粒保留率>95%。溶血實(shí)驗(yàn)顯示其無紅細(xì)胞裂解活性，符合疫苗載體安全性要求。

3. 結(jié)論

ROP18重組恥垢分枝桿菌，證實(shí)其具備穩(wěn)定蛋白分泌能力與強(qiáng)效免疫激活特性。威尼德系列儀器的精準(zhǔn)控參數(shù)保障了實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性，某試劑在關(guān)鍵步驟中表現(xiàn)出優(yōu)異穩(wěn)定性。該工程菌株為弓形蟲病亞單位疫苗開發(fā)提供了新型技術(shù)路徑，后續(xù)將開展動(dòng)物攻毒保護(hù)性實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證其應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)

1. 肖婷;魏慶寬;李瑾;黃炳成;尹昆;張清國;韓廣東;弓形蟲pcDNA3-ROP2-p30-HSP70復(fù)合基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建[J];中國血吸蟲病防治雜志;2010年04期

2. 張燕麗;曹麗艷;蘆赟;茍惠天;王艷華;付寶權(quán);李文卉;張德林;剛地弓形蟲GJS株微線體蛋白3基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及在BHK-21細(xì)胞中的表達(dá)[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2009年02期

3. 李薇;劉波;丑莉莉;弓形蟲pcDNA3-ROP1 DNA疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答及保護(hù)性的初步觀察[J];北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2008年03期

4. 劉苗苗;周鵬;朱興全;弓形蟲棒狀體蛋白的研究進(jìn)展[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2008年05期

5. 高紅剛;張佃波;卞傳秀;劉克義;弓形蟲重組恥垢分枝桿菌M.S-P30-ROP2載體活疫苗構(gòu)建及鑒定[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2007年04期

6. 江濤;張東林;聶浩;姚寶安;趙俊龍;弓形蟲MIC3基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及在IBRS-2細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2007年08期

7. 江濤;陳芳;聶浩;方瑞;姚寶安;趙俊龍;弓形蟲微線體蛋白MIC3基因的細(xì)胞免疫研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年18期

8. 孫怡;何深一;叢華;楊婷婷;周懷瑜;古欽民;李瑛;趙群力;弓形蟲SAG1-SAG2復(fù)合DNA疫苗免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫保護(hù)性[J];國際醫(yī)學(xué)寄生蟲病雜志;2006年01期