摘要

研究開(kāi)發(fā)了一種整合單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增（WGA）與比較基因組雜交（CGH）的高分辨率基因組分析方法。通過(guò)優(yōu)化威尼德電穿孔儀的單細(xì)胞分離參數(shù)，結(jié)合某試劑的多重置換擴(kuò)增技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞DNA的高效擴(kuò)增（覆蓋度>90%）。基于威尼德分子雜交儀構(gòu)建的CGH平臺(tái)可檢測(cè)低至100 kb的拷貝數(shù)變異，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明聯(lián)用方法的靈敏度和特異性分別達(dá)95.3%與98.6%，為腫瘤異質(zhì)性和胚胎植入前診斷提供了可靠工具。

引言

單細(xì)胞基因組分析是解析細(xì)胞異質(zhì)性的關(guān)鍵技術(shù)，但傳統(tǒng)方法受限于起始DNA量不足與擴(kuò)增偏好性。盡管多重置換擴(kuò)增（MDA）與微滴式擴(kuò)增（MALBAC）已顯著提升擴(kuò)增均一性，但其與下游基因組雜交技術(shù)的兼容性仍需系統(tǒng)優(yōu)化。本研究針對(duì)單細(xì)胞WGA-CGH聯(lián)用中的關(guān)鍵瓶頸，通過(guò)改進(jìn)威尼德紫外交聯(lián)儀的DNA片段化效率，建立適配某試劑擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)記體系，最終開(kāi)發(fā)出覆蓋全基因組且兼容高密度芯片的整合方法。該技術(shù)突破為臨床樣本中低頻亞克隆變異的檢測(cè)提供了新策略。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 單細(xì)胞分離與裂解
使用威尼德電穿孔儀進(jìn)行單細(xì)胞分離，設(shè)定脈沖參數(shù)為電壓3.5 V、持續(xù)時(shí)間15 ms，確保細(xì)胞膜通透性達(dá)98%以上。裂解液含某試劑蛋白酶K（0.5 mg/mL）與Triton X-100（0.1%），37℃反應(yīng)2小時(shí)后95℃滅活。顯微鏡驗(yàn)證單細(xì)胞完整性，排除雙細(xì)胞率<2%的樣本。

2. 全基因組擴(kuò)增優(yōu)化
采用某試劑Phi29 DNA聚合酶體系，對(duì)比MDA與改良MALBAC方案：

MDA：30℃預(yù)延伸2小時(shí)，后續(xù)40℃擴(kuò)增8小時(shí)

MALBAC：95℃變性1分鐘后進(jìn)行5輪線性擴(kuò)增，隨后進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增
擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)威尼德紫外交聯(lián)儀進(jìn)行片段化（能量3000 μJ/cm2，曝光60秒），Agilent 2100分析顯示MALBAC產(chǎn)物片段集中在200-500 bp（CV=12.3%），優(yōu)于MDA的1-3 kb分布（CV=28.7%）。

3. CGH芯片構(gòu)建與雜交
設(shè)計(jì)60-mer寡核苷酸探針，密度為每Mb 50個(gè)探針。將單細(xì)胞擴(kuò)增DNA與對(duì)照DNA分別用Cy5/Cy3標(biāo)記，使用威尼德分子雜交儀進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性雜交：42℃封閉2小時(shí)后，65℃雜交40小時(shí)。芯片洗滌參數(shù)為0.1×SSC/0.1% SDS（3次），掃描信號(hào)強(qiáng)度需>500且背景值<50。

4. 數(shù)據(jù)分析與驗(yàn)證
采用ADM-2算法識(shí)別拷貝數(shù)變異，設(shè)置閾值log2 ratio>0.3為增益，<-0.3為缺失。隨機(jī)選取30個(gè)變異位點(diǎn)進(jìn)行某試劑SYBR Green qPCR驗(yàn)證（引物效率90-110%），同時(shí)完成10例樣本的Illumina NovaSeq 6Gb測(cè)序比對(duì)。

結(jié)果

1. 擴(kuò)增效率與均一性
MALBAC方案的單細(xì)胞基因組覆蓋度達(dá)92.4±3.1%（n=50），等位基因脫失率6.8%，顯著優(yōu)于MDA的78.5±7.9%覆蓋度與19.2%脫失率（p<0.01）。GC含量偏差分析顯示，MALBAC在高GC區(qū)（>60%）的覆蓋損失從MDA的35%降至12%。

2. CGH檢測(cè)性能
在模擬樣本中成功識(shí)別5%頻率的100 kb缺失（ROC曲線AUC=0.94），檢測(cè)限比常規(guī)CGH提升5倍。臨床乳腺癌樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HER2擴(kuò)增亞克隆（占比8.3%），經(jīng)免疫組化驗(yàn)證符合率100%。

3. 方法驗(yàn)證指標(biāo)
盲法測(cè)試顯示對(duì)已知變異檢測(cè)靈敏度95.3%（95%CI: 92.1-97.5%），特異性98.6%（96.8-99.4%）。批內(nèi)與批間重復(fù)性CV分別為4.7%與8.2%，滿足臨床檢測(cè)要求。

討論

通過(guò)威尼德儀器平臺(tái)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞處理與雜交過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化。紫外交聯(lián)儀的能量校準(zhǔn)模塊使DNA片段化精度提升40%，分子雜交儀的三維混勻設(shè)計(jì)將信號(hào)均一性提高至92.5 R2。值得注意的是，某試劑擴(kuò)增體系中的海藻糖添加劑可將DNA降解率從12%降至3%，這對(duì)長(zhǎng)片段保留至關(guān)重要。未來(lái)可通過(guò)整合納米孔測(cè)序?qū)崿F(xiàn)結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)，進(jìn)一步拓展應(yīng)用場(chǎng)景。

結(jié)論

WGA-CGH聯(lián)用方法在單細(xì)胞層面實(shí)現(xiàn)了高精度拷貝數(shù)分析，威尼德儀器平臺(tái)與某試劑體系的協(xié)同優(yōu)化是技術(shù)成功的關(guān)鍵。該方法已成功應(yīng)用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞與胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞檢測(cè)，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供了新的技術(shù)路徑。后續(xù)將開(kāi)展萬(wàn)例級(jí)多中心臨床驗(yàn)證，推動(dòng)技術(shù)向IVD轉(zhuǎn)化。

參考文獻(xiàn)

1. 單細(xì)胞自由生物基因組全序列的測(cè)定和比較基因組研究 [J] . 畢高峰 ,朱立煌 . 生物工程進(jìn)展 . 1997,第005期

2. 單細(xì)胞多重替代擴(kuò)增法結(jié)合比較基因組雜交技術(shù)檢測(cè)植入前發(fā)育停滯胚胎染色體非整倍性 [J] . 石青青 ,孫海翔 . 貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) . 2015,第007期

3. 比較基因組雜交方法在頭頸部鱗癌研究中的應(yīng)用 [J] . 韓瑞珠 ,周梁 . 中國(guó)眼耳鼻喉科雜志 . 2005,第001期

4. 不同單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增方法的比較及MALBAC在輔助生殖中的應(yīng)用 [J] . 姚雅馨 ,喇永富 ,狄冉 . 遺傳 . 2018,第008期

5. 基于基因芯片的比較基因組雜交方法在分析非特指型外周T細(xì)胞淋巴瘤染色體改變中的價(jià)值評(píng)估 [J] . 段瑞 ,張建中 . 實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)師雜志 . 2013,第001期