摘要

通過構(gòu)建CD244基因轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細胞株，并基于此制備特異性單克隆抗體。實驗采用電穿孔儀（威尼德）完成基因轉(zhuǎn)染，篩選獲得高表達細胞株；通過免疫動物及雜交瘤技術(shù)獲得抗體，經(jīng)ELISA、Western blot驗證其特異性。研究為CD244功能研究及靶向治療提供了可靠工具，實驗流程具有可重復(fù)性。

引言

CD244基因編碼的蛋白屬于信號淋巴細胞活化分子家族（SLAM），在免疫調(diào)節(jié)及腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。近年研究表明，CD244在多種癌癥中異常表達，但其具體作用機制尚不明確。構(gòu)建穩(wěn)定表達CD244的細胞株及高特異性抗體，是解析其生物學(xué)功能的關(guān)鍵。現(xiàn)有研究多采用瞬時轉(zhuǎn)染或商業(yè)化抗體，存在表達不穩(wěn)定或交叉反應(yīng)等問題。為此，本研究旨在通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建CD244過表達細胞株，并基于此開發(fā)高親和力單克隆抗體，為后續(xù)機制探索及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1. 實驗部分

1. 材料與方法

1.1 實驗材料

1. 細胞與質(zhì)粒：人胚腎HEK293T細胞，CD244基因全長克隆至pCDNA3.1載體（某試劑）。

2. 儀器：電穿孔儀、紫外交聯(lián)儀、分子雜交儀（均為威尼德）；流式細胞儀（某品牌）。

3. 試劑：Lipofectamine 3000（某試劑）、G418篩選培養(yǎng)基（某試劑）、弗氏佐劑（某試劑）。

1.2 CD244穩(wěn)定細胞株構(gòu)建

1.2.1 質(zhì)粒擴增與純化
將CD244-pCDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，經(jīng)LB培養(yǎng)基擴增后，使用某試劑盒純化質(zhì)粒，測定濃度及純度（A260/A280>1.8）。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染與篩選
HEK293T細胞以電穿孔儀（威尼德）轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整密度至1×10^6/mL，與20 μg質(zhì)粒混合后，參數(shù)設(shè)為電壓250 V、脈沖時間10 ms。轉(zhuǎn)染后48小時，加入含800 μg/mL G418（某試劑）的培養(yǎng)基篩選14天，每3天更換培養(yǎng)基。通過有限稀釋法獲得單克隆細胞株。

1.2.3 表達驗證

1. 流式細胞術(shù)：細胞經(jīng)抗CD244一抗（某試劑）及FITC標記二抗（某試劑）染色，流式細胞儀（某品牌）檢測陽性率。

2. Western blot：裂解細胞后取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜后以CD244抗體（某試劑）及HRP標記二抗（某試劑）顯影。

1.3 單克隆抗體制備

1.3.1 動物免疫
選取6周齡BALB/c小鼠，以CD244過表達細胞裂解液（100 μg/次）與弗氏佐劑（某試劑）乳化后皮下注射，間隔2周加強免疫3次。末次免疫7天后取脾細胞。

1.3.2 細胞融合與篩選
脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞以5:1比例混合，采用PEG（某試劑）誘導(dǎo)融合。融合后細胞接種于HAT培養(yǎng)基（某試劑），37℃、5% CO2培養(yǎng)10天。通過ELISA篩選上清液陽性孔：包被CD244重組蛋白（某試劑），加入雜交瘤上清，HRP標記二抗（某試劑）顯色，OD450>0.5判定為陽性。

1.3.3 亞克隆與抗體純化
陽性孔細胞經(jīng)有限稀釋法亞克隆3次，獲得穩(wěn)定分泌抗體的單克隆株。擴大培養(yǎng)后收集上清，經(jīng)Protein A親和層析（某試劑）純化抗體，BCA法測定濃度。

1.4 抗體特性分析

1. 親和力檢測：采用表面等離子共振（SPR，某品牌）分析抗體與CD244結(jié)合動力學(xué)。

2. 特異性驗證：Western blot檢測抗體對轉(zhuǎn)染細胞及陰性對照細胞的反應(yīng)性；免疫組化分析組織切片中CD244表達定位。

2. 結(jié)果與討論

2.1 CD244穩(wěn)定細胞株構(gòu)建
經(jīng)G418篩選及流式分選，獲得3株CD244高表達HEK293T細胞（陽性率>95%）。Western blot顯示轉(zhuǎn)染細胞中CD244蛋白條帶清晰，分子量約70 kDa，與預(yù)期一致。

2.2 單克隆抗體制備
ELISA初篩獲得12孔陽性雜交瘤，經(jīng)亞克隆后最終獲得2株穩(wěn)定分泌抗體的細胞株（分別命名為mAb-3F2、mAb-5D8）。SPR檢測顯示mAb-3F2親和力KD值為1.2×10^-9 M，優(yōu)于已報道的同類抗體。Western blot證實兩者僅與CD244過表達細胞發(fā)生特異性結(jié)合。

2.3 應(yīng)用潛力分析
研究構(gòu)建的細胞株為CD244信號通路研究提供了穩(wěn)定模型；所獲單克隆抗體在流式分選、免疫組化中均表現(xiàn)優(yōu)異，未來可進一步用于腫瘤免疫治療靶點驗證。

結(jié)論

研究成功構(gòu)建CD244穩(wěn)定表達細胞株，并制備出高特異性單克隆抗體。實驗通過優(yōu)化電穿孔參數(shù)（威尼德）及篩選策略，顯著提升轉(zhuǎn)染效率與抗體親和力。研究成果為CD244相關(guān)疾病機制研究及診斷試劑開發(fā)提供了重要工具。

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