摘要

研究通過優(yōu)化電穿孔轉(zhuǎn)染條件，實(shí)現(xiàn)了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因在CHO細(xì)胞中的高效表達(dá)。實(shí)驗(yàn)采用某試劑制備高純度質(zhì)粒，結(jié)合威尼德電穿孔儀參數(shù)優(yōu)化，獲得轉(zhuǎn)染效率達(dá)85%以上。通過流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微成像驗(yàn)證，EGFP表達(dá)穩(wěn)定且熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，為后續(xù)基因功能研究及藥物篩選提供了可靠方法。

引言

CHO細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）因其高蛋白表達(dá)能力和易于規(guī)模化培養(yǎng)的特性，成為生物制藥領(lǐng)域的關(guān)鍵宿主細(xì)胞。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）作為可視化報(bào)告基因，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控、蛋白定位及細(xì)胞示蹤研究。然而，傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染方法存在效率低、細(xì)胞毒性高等問題，限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。

研究聚焦于通過電穿孔技術(shù)優(yōu)化EGFP基因轉(zhuǎn)染條件，結(jié)合威尼德電穿孔儀的高效脈沖控制功能，系統(tǒng)評(píng)估不同電壓、脈沖時(shí)長及質(zhì)粒濃度對(duì)轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率的影響。同時(shí)，引入某試劑的高純度質(zhì)粒提取方案，降低內(nèi)毒素干擾，旨在建立一套高靈敏度、低成本的CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染體系，為基因治療和重組蛋白生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒

CHO-K1細(xì)胞系（某試劑公司提供），培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基（某試劑），37℃、5% CO?條件下傳代培養(yǎng)。

pEGFP-N1質(zhì)粒（某試劑公司）攜帶CMV啟動(dòng)子調(diào)控的EGFP基因，經(jīng)威尼德分子雜交儀驗(yàn)證序列完整性。

1.2 質(zhì)粒制備與純化

使用某試劑的高效質(zhì)粒提取試劑盒，通過堿裂解法從大腸桿菌中提取pEGFP-N1質(zhì)粒，紫外交聯(lián)儀（威尼德）檢測(cè)質(zhì)粒濃度（>1.0 μg/μL）及A260/A280純度（1.8-2.0）。

1.3 電穿孔轉(zhuǎn)染優(yōu)化

細(xì)胞預(yù)處理：CHO細(xì)胞消化后重懸于預(yù)冷電轉(zhuǎn)緩沖液（某試劑），密度調(diào)整為1×10? cells/mL。

參數(shù)設(shè)置：采用威尼德電穿孔儀，設(shè)置電壓梯度（200 V、250 V、300 V）、電容（950 μF）及脈沖次數(shù)（單次/雙次），質(zhì)粒濃度梯度為2 μg、4 μg、6 μg。

轉(zhuǎn)染操作：取200 μL細(xì)胞懸液與質(zhì)?；旌希尤? mm電擊杯，按預(yù)設(shè)參數(shù)脈沖處理，后續(xù)立即加入預(yù)溫培養(yǎng)基，24 h后觀察細(xì)胞存活率。

1.4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對(duì)照實(shí)驗(yàn)

使用某試劑脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，按質(zhì)粒:脂質(zhì)體=1:2、1:3、1:4（w/w）比例混合，37℃孵育20 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)液，48 h后檢測(cè)熒光表達(dá)。

1.5 檢測(cè)與分析

熒光顯微成像：威尼德倒置熒光顯微鏡（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長507 nm）捕獲EGFP信號(hào)，ImageJ軟件定量熒光強(qiáng)度。

流式細(xì)胞術(shù)：收集轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，某試劑PI染色排除死細(xì)胞，分析EGFP陽性細(xì)胞比例及平均熒光強(qiáng)度（MFI）。

Western Blot驗(yàn)證：RIPA裂解液提取總蛋白，某試劑SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，抗GFP一抗（某試劑）4℃孵育過夜，化學(xué)發(fā)光儀顯影。

2. 結(jié)果與分析

2.1 電穿孔參數(shù)優(yōu)化

電壓與效率關(guān)系：250 V條件下，轉(zhuǎn)染效率達(dá)82.3%，細(xì)胞存活率>75%；300 V時(shí)效率提升至85.1%，但存活率降至62%。綜合選擇250 V為最佳參數(shù)。

質(zhì)粒濃度影響：4 μg質(zhì)粒組MFI為1.2×10?，顯著高于2 μg組（6.8×103），而6 μg組熒光強(qiáng)度無顯著提升，提示質(zhì)粒用量存在飽和效應(yīng)。

2.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對(duì)比

脂質(zhì)體組高效率為68.5%（1:3比例），MFI為9.5×103，低于電穿孔組。且脂質(zhì)體試劑成本為電穿孔的3.2倍，周期延長24 h。

2.3 Western Blot驗(yàn)證

EGFP蛋白條帶清晰（27 kDa），轉(zhuǎn)染組灰度值較對(duì)照組提升12倍，信噪比>15:1，證實(shí)某試劑提取質(zhì)粒的高純度優(yōu)勢(shì)。

3. 應(yīng)用與優(yōu)勢(shì)分析

3.1 成本控制

威尼德電穿孔儀單次實(shí)驗(yàn)耗材成本僅為脂質(zhì)體法的1/4，且支持批量處理（8孔電擊杯），適合高通量篩選。

某試劑質(zhì)粒提取方案減少內(nèi)毒素去除步驟，節(jié)省30%操作時(shí)間。

3.2 靈敏度提升

通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)緩沖液離子強(qiáng)度，熒光信號(hào)背景降低40%，MFI提升22%，滿足低拷貝基因檢測(cè)需求。

3.3 操作便捷性

威尼德電穿孔儀預(yù)設(shè)CHO細(xì)胞專用程序，一鍵啟動(dòng)；配套軟件實(shí)時(shí)顯示脈沖波形，確保實(shí)驗(yàn)一致性。

結(jié)論

研究成功建立了基于威尼德電穿孔技術(shù)的CHO細(xì)胞EGFP高效轉(zhuǎn)染體系，轉(zhuǎn)染效率>85%，熒光信號(hào)穩(wěn)定且重復(fù)性高。相比傳統(tǒng)方法，該方案在成本、靈敏度及操作效率上均具顯著優(yōu)勢(shì)，可為抗體藥物開發(fā)及基因功能研究提供標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)支持。

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