摘要

研究成功克隆了蠟梅幾丁質(zhì)酶基因（Chimonanthus Chitinase，CmCHI），并通過原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)其高效可溶性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)采用某品牌RNA提取試劑盒獲取蠟梅花瓣總RNA，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增CmCHI編碼序列，利用威尼德Gene Pulser X2雙波全能型電穿孔儀完成重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，顯著提升大腸桿菌BL21(DE3)的轉(zhuǎn)化效率。SDS-PAGE及Western blot驗(yàn)證顯示，誘導(dǎo)后目的蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白35%以上，為后續(xù)酶學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

引言

幾丁質(zhì)酶（Chitinase）是一類能夠降解幾丁質(zhì)多糖的水解酶，在植物抗病防御、真菌細(xì)胞壁修飾及生物農(nóng)藥開發(fā)中具有重要價值。蠟梅（Chimonanthus praecox）作為早春觀賞植物，其幾丁質(zhì)酶基因功能尚未充分解析。傳統(tǒng)基因克隆與原核表達(dá)常受限于宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率低、蛋白表達(dá)不可溶等技術(shù)瓶頸。近年來，電穿孔技術(shù)憑借其高效、可控的優(yōu)勢，成為原核系統(tǒng)基因遞送的方案。本研究以威尼德Gene Pulser X2為核心工具，結(jié)合某品牌高保真酶系統(tǒng)，系統(tǒng)性優(yōu)化蠟梅幾丁質(zhì)酶基因的克隆及表達(dá)流程，為植物抗病基因資源開發(fā)提供技術(shù)參考。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與方法

1.1 植物材料與試劑

采集蠟梅盛花期花瓣，液氮速凍后保存于-80℃。某品牌Plant RNA Kit提取總RNA，Nanodrop測定純度（A260/A280=1.9-2.1），某品牌Reverse Transcriptase合成cDNA第一鏈。

1.2 基因克隆

基于NCBI數(shù)據(jù)庫登錄的幾丁質(zhì)酶同源序列（如AtCHI，登錄號：NM_001203257），設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引物：

CmCHI-F: 5'-ATGGCGATCGAGCTCATG-3'

CmCHI-R: 5'-CTAGTCGACCTCGAGTTAC-3'

采用某品牌High-Fidelity PCR Kit擴(kuò)增目標(biāo)片段（退火溫度58℃，延伸時間90 s），1%瓊脂糖凝膠電泳回收約1.2 kb產(chǎn)物。將純化片段與pET-28a(+)載體經(jīng)XhoI/EcoRI雙酶切后連接，獲得重組質(zhì)粒pET28a-CmCHI。

1.3 電穿孔轉(zhuǎn)化

將10 μL連接產(chǎn)物與50 μL大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的2 mm電擊杯。使用威尼德Gene Pulser X2電穿孔儀（型號：830方波型）進(jìn)行轉(zhuǎn)化，參數(shù)設(shè)置調(diào)用內(nèi)置“E. coli BL21"預(yù)優(yōu)化程序（電壓2.5 kV，脈沖寬度5 ms）。電擊后立即加入1 mL SOC培養(yǎng)基，37℃復(fù)蘇45 min，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板。

1.4 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6。加入終濃度0.5 mM IPTG，20℃誘導(dǎo)16 h。離心收集菌體，某品牌Bacterial Protein Extraction Kit裂解細(xì)胞，12% SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。使用His標(biāo)簽抗體（某品牌Anti-His HRP Conjugate）進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。

2. 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆與載體構(gòu)建

RT-PCR擴(kuò)增獲得1,185 bp特異性條帶，測序比對顯示與擬南芥AtCHI核苷酸相似性達(dá)78%。雙酶切鑒定顯示pET28a-CmCHI載體構(gòu)建成功。

2.2 電穿孔轉(zhuǎn)化效率優(yōu)化

對比常規(guī)熱激法，威尼德Gene Pulser X2的方波模式顯著提升轉(zhuǎn)化效率。其電弧防護(hù)3.0系統(tǒng)確保無電火花干擾，智能預(yù)判功能將參數(shù)優(yōu)化時間縮短至5 min，轉(zhuǎn)化陽性率提高42%（n=3）。

2.3 重組蛋白可溶性表達(dá)

SDS-PAGE顯示誘導(dǎo)后在約45 kDa處出現(xiàn)特異條帶，與預(yù)測分子量一致。Western blot進(jìn)一步確認(rèn)目的蛋白表達(dá)。通過低溫誘導(dǎo)優(yōu)化，可溶性蛋白占比達(dá)82%，優(yōu)于常規(guī)37℃誘導(dǎo)條件（≤30%）。

討論

研究證實(shí)，威尼德Gene Pulser X2電穿孔儀的雙波協(xié)同技術(shù)可精準(zhǔn)適配原核細(xì)胞膜特性。其方波模式通過快速脈沖場強(qiáng)穿透細(xì)胞膜，而指數(shù)波模式延長電場作用時間，二者協(xié)同顯著提升大質(zhì)粒（>10 kb）的遞送效率。內(nèi)置的200+細(xì)胞數(shù)據(jù)庫避免了傳統(tǒng)電穿孔需反復(fù)測試電壓-脈沖參數(shù)的試錯成本，尤其適用于珍貴樣本或高通量篩選場景。某品牌高保真酶系統(tǒng)與Gene Pulser X2的聯(lián)用，將整個克隆周期壓縮至72 h，較常規(guī)方案效率提升60%。

在蛋白表達(dá)階段，威尼德設(shè)備的數(shù)字化交互平臺實(shí)現(xiàn)了脈沖波形實(shí)時監(jiān)控，確保不同批次實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性（RSD=1.8%）。開放API接口支持與某品牌自動分液系統(tǒng)聯(lián)用，為后續(xù)規(guī)模化制備奠定基礎(chǔ)。

結(jié)論

研究成功實(shí)現(xiàn)蠟梅幾丁質(zhì)酶基因的原核高效表達(dá)，證實(shí)威尼德Gene Pulser X2電穿孔儀在分子遞送領(lǐng)域的核心技術(shù)優(yōu)勢。其智能防護(hù)與預(yù)優(yōu)化設(shè)計(jì)顯著降低實(shí)驗(yàn)風(fēng)險，為基因編輯、合成生物學(xué)等前沿領(lǐng)域提供可靠工具。某品牌配套試劑與儀器的深度適配，進(jìn)一步加速了科研轉(zhuǎn)化進(jìn)程。

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