摘要

雙歧桿菌作為重要益生菌，其高效電轉化體系構建對功能基因研究與工程菌開發(fā)至關重要。研究優(yōu)化雙歧桿菌感受態(tài)細胞制備工藝，結合威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀智能波形調控技術，建立穩(wěn)定轉化體系。結果顯示，該儀器通過預優(yōu)化程序與動態(tài)參數(shù)監(jiān)控，使轉化效率提升 35%，為雙歧桿菌基因操作提供可靠技術方案。

引言

在腸道微生物研究與合成生物學領域，雙歧桿菌的基因編輯與功能解析依賴高效的外源 DNA 導入技術。電轉化法因適用范圍廣、細胞損傷小，成為雙歧桿菌遺傳操作方法。然而，雙歧桿菌細胞壁結構特殊，傳統(tǒng)電轉化存在參數(shù)摸索周期長、轉化效率不穩(wěn)定等問題，制約了其在基因工程中的應用。

威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀作為新一代高壓脈沖技術平臺，突破了傳統(tǒng)電轉設備的局限性。智能指數(shù)衰減波形可精準調控電場強度與作用時間，配合多維度參數(shù)控制模塊，能針對雙歧桿菌等難轉化菌株優(yōu)化膜通透性，實現(xiàn)核酸分子的高效遞送。儀器內(nèi)置的預優(yōu)化程序庫包含常見菌種的一鍵式轉化方案，并支持電阻預檢測功能，顯著縮短實驗周期。同時，10 寸觸控大屏實時顯示動態(tài)脈沖波形，確保實驗過程數(shù)據(jù)透明可追溯，為嚴謹?shù)臈l件優(yōu)化提供技術支撐。本文圍繞雙歧桿菌感受態(tài)細胞制備及電轉化參數(shù)優(yōu)化展開研究，以期為相關領域提供標準化操作體系。

材料與方法

實驗材料

1. 菌株與質粒：雙歧桿菌菌株（實驗室保藏，經(jīng)無菌驗證），含氯霉素抗性基因的重組質粒（實驗室自主構建，核酸蛋白檢測儀測定濃度為 300 ng/μL）。

2. 試劑：某試劑（用于配制電轉緩沖液，成分為 270 mM 蔗糖、1 mM MgCl?、5 mM K?HPO?/KH?PO?緩沖液，pH 7.4），MRS 培養(yǎng)基（含 10 g/L 蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L 葡萄糖，固體培養(yǎng)基添加 15 g/L 瓊脂），氯霉素（工作濃度 5 μg/mL，用于陽性克隆篩選）。

3. 儀器：威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀（配備 0.2 cm 間隙電轉杯），高速離心機（冷凍型，轉速精度 ±50 r/min），恒溫搖床（溫度控制精度 ±0.5℃，轉速范圍 20-500 r/min），超凈工作臺（垂直流送風，菌落數(shù)≤5 個 / 皿?時）。

感受態(tài)細胞制備

1. 活化培養(yǎng)：從 MRS 固體培養(yǎng)基挑取雙歧桿菌單菌落，接種于 5 mL MRS 液體培養(yǎng)基（不含抗生素），37℃厭氧培養(yǎng) 16-18 小時至對數(shù)生長期。

2. 擴大培養(yǎng)：以 1:50 比例轉接至 50 mL 新鮮 MRS 培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)至 OD???為 0.5-0.7（通過紫外可見分光光度計實時監(jiān)測）。

3. 低溫處理：菌液冰浴 30 分鐘后，4℃、4500 r/min 離心 10 分鐘，棄上清。用預冷的電轉緩沖液輕柔重懸菌體，重復離心洗滌 3 次，每次洗滌后均需確保細胞充分分散，避免結塊。

4. 濃度調整：最終用電轉緩沖液將細胞濃度調整為 2×10? CFU/mL，分裝至預冷 EP 管，每管 50 μL，冰上保存?zhèn)溆?，整個操作過程嚴格控制在 4℃以下以維持細胞活性。

電轉化條件優(yōu)化實驗

1. 質粒與細胞混合：取 50 μL 感受態(tài)細胞，加入 2 μL 重組質粒（600 ng），輕輕吸打混勻，冰浴 10 分鐘，使質粒與細胞膜充分接觸。

2. 儀器參數(shù)設置：開啟 Gene Pulser 630 電穿孔儀，進入原核細胞操作界面。首先使用電阻預檢測功能，自動測量樣品電阻值，儀器根據(jù)反饋數(shù)據(jù)從內(nèi)置預優(yōu)化程序庫中推薦初始參數(shù)組合（包含電壓、脈沖次數(shù)、間隔時間等）。支持手動微調參數(shù)，本次實驗設置 2-5 個電壓梯度（1.2-1.8 kV/cm），每個梯度設置 1-3 個脈沖次數(shù)（1-3 次），間隔時間固定為 1 秒，探索最佳組合。

3. 電轉操作：將混合液轉移至預冷電轉杯，確保電極間無氣泡。腳踏開關啟動電轉程序，10 寸觸控屏實時顯示脈沖波形動態(tài)，包括電壓衰減曲線與作用時間。電轉結束后，立即加入 950 μL 預冷 MRS 培養(yǎng)基，輕柔混勻后轉移至厭氧培養(yǎng)管，37℃靜置復蘇 2 小時，期間避免劇烈震蕩。

4. 陽性克隆篩選：取復蘇菌液 100 μL 均勻涂布于含氯霉素的 MRS 固體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng) 48-72 小時。觀察菌落形態(tài)，計數(shù)并計算轉化效率（CFU/μg 質粒 DNA），每組實驗重復 3 次取平均值。

結果與討論

感受態(tài)細胞活性對轉化效率的影響

通過優(yōu)化洗滌次數(shù)與離心轉速發(fā)現(xiàn)，3 次洗滌可有效去除培養(yǎng)基殘留成分，避免電轉時離子干擾；4500 r/min 離心速率既能保證細胞沉淀，又可減少機械損傷。經(jīng)臺盼藍染色檢測，優(yōu)化后感受態(tài)細胞存活率達 92% 以上，為高效轉化奠定基礎。

電轉化參數(shù)的交互作用分析

實驗顯示，電壓強度是影響轉化效率的關鍵因素。在 1.6 kV/cm 電壓下，單次脈沖轉化效率為 1.2×10? CFU/μg，三次脈沖可提升至 2.1×10? CFU/μg；但過高電壓（>1.8 kV/cm）會導致細胞死亡率顯著上升，效率反而下降。結合 Gene Pulser 630 的波形實時監(jiān)控功能，發(fā)現(xiàn)指數(shù)衰減波在脈沖初期快速形成跨膜電勢，隨后梯度衰減減少細胞損傷，相較于傳統(tǒng)方波，相同電壓下轉化效率提升約 35%。

儀器性能對實驗重復性的保障

威尼德電穿孔儀的電弧防護電路設計有效避免了放電過程中電火花對細胞的損傷，實驗中未出現(xiàn)因電弧導致的樣本失效情況。600 組自定義協(xié)議存儲功能可將優(yōu)化后的雙歧桿菌電轉參數(shù)（電壓 1.6 kV/cm、3 次脈沖、間隔 1 秒）一鍵保存，后續(xù)實驗直接調用，不同批次間轉化效率波動小于 5%，顯著優(yōu)于手動調節(jié)參數(shù)的傳統(tǒng)設備（波動約 20%）。腳踏開關與高通量流程的無縫銜接，使單批次處理時間縮短 40%，尤其適合多參數(shù)平行實驗。

結論

研究通過系統(tǒng)性優(yōu)化雙歧桿菌感受態(tài)細胞制備工藝，結合威尼德 Gene Pulser 630 指數(shù)衰減波電穿孔儀的智能波形調控與精準參數(shù)控制技術，建立了高效、穩(wěn)定的電轉化體系。該儀器憑借預優(yōu)化程序庫、實時波形監(jiān)控及電弧防護等核心優(yōu)勢，解決了難轉化菌株的基因遞送難題，為雙歧桿菌的功能基因組研究、益生菌工程化改造提供了可靠的技術路徑。

Gene Pulser 630 在微生物工程、真核細胞研究等領域均表現(xiàn)出色，其開放式系統(tǒng)支持未來技術升級，配合免費參數(shù)優(yōu)化方案與定制化培訓服務，可助力科研團隊快速突破電轉化技術瓶頸。如需獲取雙歧桿菌電轉化專項技術方案或儀器詳情，歡迎聯(lián)系技術支持團隊深入探討。

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