摘要：本研究旨在建立一種高效電穿孔介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染原代軟骨細(xì)胞的方法，以實(shí)現(xiàn)基因沉默效果并維持較高的細(xì)胞存活率。通過(guò)優(yōu)化電穿孔參數(shù)和使用高效電轉(zhuǎn)緩沖液，成功實(shí)現(xiàn)了siRNA的高效轉(zhuǎn)染，為基因功能研究和疾病機(jī)制探討提供了有力工具。

引言

在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，RNA干擾（RNAi）技術(shù)已成為研究基因功能和疾病機(jī)制的重要工具。小干擾RNA（siRNA）作為RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)分子，能夠特異性地沉默目標(biāo)基因的表達(dá)。然而，由于細(xì)胞類(lèi)型的多樣性和siRNA的自身特性，siRNA的轉(zhuǎn)染過(guò)程面臨諸多挑戰(zhàn)。原代軟骨細(xì)胞作為一類(lèi)難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類(lèi)型，其基因功能的研究尤為困難。因此，建立一種高效、穩(wěn)定的siRNA轉(zhuǎn)染原代軟骨細(xì)胞的方法具有重要的科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

電穿孔法是一種利用短暫的高壓電脈沖在細(xì)胞膜上形成瞬時(shí)小孔，使外源分子能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)。該方法具有轉(zhuǎn)染效率高、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于一些難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類(lèi)型。本研究旨在通過(guò)優(yōu)化電穿孔參數(shù)和使用高效電轉(zhuǎn)緩沖液，建立一種高效電穿孔介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染原代軟骨細(xì)胞的方法，以實(shí)現(xiàn)基因沉默效果并維持較高的細(xì)胞存活率。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

• 細(xì)胞：出生后5天的FVB品系小鼠，用于分離原代軟骨細(xì)胞。

• 試劑：某試劑Ⅰ型膠原酶、某試劑Ⅱ型膠原酶、某試劑鏈絲菌蛋白酶、某品牌高效電轉(zhuǎn)緩沖液、某品牌臺(tái)盼藍(lán)染色劑、某品牌pCMV-EGFP表達(dá)質(zhì)粒、某品牌siRNA（對(duì)照siRNA和Sox9 siRNA）。

• 儀器：威尼德電穿孔儀、某品牌熒光顯微鏡、某品牌實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、某品牌Western blot分析系統(tǒng)。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

• 原代軟骨細(xì)胞的分離：取出生后5天的FVB品系小鼠2只，分離四肢關(guān)節(jié)及肋軟骨，加入含0.1%Ⅰ型膠原酶的DMEM培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃消化1小時(shí)。然后在解剖鏡下刷去軟骨外的軟組織，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍后，再用0.2%Ⅱ型膠原酶37℃消化過(guò)夜。第2天，加入1mg/ml鏈絲菌蛋白酶繼續(xù)消化3小時(shí)，期間每隔1小時(shí)吹打1次。

• 電穿孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒：將獲取的單個(gè)軟骨細(xì)胞在室溫下用PBS洗兩遍，計(jì)數(shù)。用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細(xì)胞（5×10^5個(gè)細(xì)胞/100微升），每100微升電轉(zhuǎn)緩沖液中加入5微克pCMV-EGFP-C1質(zhì)粒，混勻后加入電轉(zhuǎn)杯（2毫米間隙）中。電穿孔儀采用170V/15ms的參數(shù)進(jìn)行電轉(zhuǎn)。電穿孔后立刻加入1毫升已預(yù)溫的高糖DMEM培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)皿中，取少許細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞活率，其余的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。

• 轉(zhuǎn)染效率確定：電穿孔后48小時(shí)，在熒光顯微鏡下隨機(jī)取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)表達(dá)綠色熒光蛋白（發(fā)綠光）的細(xì)胞數(shù)，同時(shí)在可見(jiàn)光下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。計(jì)算轉(zhuǎn)染率（%）=（發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。

• siRNA轉(zhuǎn)染及基因沉默效果的評(píng)估：將處理得到的原代軟骨細(xì)胞，用電轉(zhuǎn)緩沖液重懸細(xì)胞（5×10^5個(gè)細(xì)胞/100微升），在每100微升電轉(zhuǎn)緩沖液中加入5微升10微摩爾/升的對(duì)照siRNA或Sox9 siRNA，混勻后加入電轉(zhuǎn)杯（2毫米間隙）中，選擇170V/15ms進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)后加入培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)。收獲細(xì)胞用常規(guī)方法提取總RNA和總蛋白，進(jìn)行real-time PCR以及Western blot法檢測(cè)分析Sox9的mRNA和蛋白表達(dá)量。

• real-time PCR分析：將總RNA用DNAase處理后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后采用SYBR Green反應(yīng)體系進(jìn)行real-time PCR分析。

• Western blot法分析：將得到的總蛋白定量后進(jìn)行裂解變性，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1小時(shí)后沿60kDa marker處裁開(kāi)，分別加入一抗Sox9抗體與β-actin抗體，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次5分鐘，分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)，TBST洗膜3次后，化學(xué)曝光顯影。并用隨機(jī)附帶軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值掃描，計(jì)算出Sox9與內(nèi)參β-actin的灰度值比值，進(jìn)行蛋白的半定量分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 細(xì)胞存活率：電穿孔后原代軟骨細(xì)胞的存活率大于80%，表明優(yōu)化后的電穿孔參數(shù)對(duì)細(xì)胞損傷較小，能夠維持較高的細(xì)胞存活率。

2. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率：質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到37.3%±5.2%，說(shuō)明高效電轉(zhuǎn)緩沖液和優(yōu)化的電穿孔參數(shù)能夠提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。

3. siRNA靶分子的mRNA和蛋白表達(dá)水平：轉(zhuǎn)染Sox9 siRNA后，原代軟骨細(xì)胞中的Sox9 mRNA和蛋白表達(dá)水平分別下調(diào)了75%和66%，達(dá)到了理想的基因沉默效果。

討論

1. 電穿孔參數(shù)的選擇：電穿孔參數(shù)的選擇是影響轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵因素。本研究通過(guò)優(yōu)化電穿孔參數(shù)，如電壓、脈沖時(shí)間和脈沖次數(shù)等，成功實(shí)現(xiàn)了siRNA的高效轉(zhuǎn)染。同時(shí)，細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞密度、siRNA的濃度等也會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染效果產(chǎn)生影響，需要在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行優(yōu)化。

2. 鏈絲菌蛋白酶的作用：原代軟骨細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)，這些細(xì)胞外基質(zhì)在軟骨細(xì)胞周?chē)纬奢^致密的結(jié)構(gòu)，影響電穿孔的效率。本研究使用鏈絲菌蛋白酶對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步消化，并通過(guò)間斷吹打促使其細(xì)胞外基質(zhì)的酶解，從而提高了電穿孔的效率。

3. 高效電轉(zhuǎn)緩沖液的應(yīng)用：高效電轉(zhuǎn)緩沖液能夠提高一些普遍認(rèn)為難以電轉(zhuǎn)的細(xì)胞的存活率與轉(zhuǎn)染效率。本研究選用的高效電轉(zhuǎn)緩沖液適用于原代軟骨細(xì)胞，能夠在保證較高細(xì)胞存活率的同時(shí)達(dá)到滿(mǎn)意的RNAi效果。

4. siRNA的選擇與設(shè)計(jì)：siRNA的序列設(shè)計(jì)是實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)。本研究選擇了針對(duì)Sox9基因的siRNA，并保證了其二級(jí)結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)穩(wěn)定性，從而提高了基因沉默效率。同時(shí)，siRNA的濃度和轉(zhuǎn)染時(shí)間也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效果，需要在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行優(yōu)化。

策略與創(chuàng)新

1. 策略：本研究通過(guò)優(yōu)化電穿孔參數(shù)、使用高效電轉(zhuǎn)緩沖液和鏈絲菌蛋白酶消化等方法，成功建立了高效電穿孔介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染原代軟骨細(xì)胞的方法。該方法具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞存活率高等優(yōu)點(diǎn)，為基因功能研究和疾病機(jī)制探討提供了有力工具。

2. 創(chuàng)新：本研究將電穿孔法應(yīng)用于原代軟骨細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染，并成功實(shí)現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)染和基因沉默。同時(shí)，通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件和方法，提高了轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率，為其他難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類(lèi)型提供了借鑒和參考。

應(yīng)用前景

本研究建立的高效電穿孔介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染原代軟骨細(xì)胞的方法具有廣泛的應(yīng)用前景。首先，該方法可以用于研究軟骨細(xì)胞相關(guān)基因的功能和調(diào)控機(jī)制，為軟骨疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。其次，該方法還可以用于篩選和鑒定針對(duì)軟骨疾病的潛在藥物靶點(diǎn)，為藥物研發(fā)提供有力支持。此外，該方法還可以擴(kuò)展到其他難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類(lèi)型，為生命科學(xué)研究和疾病機(jī)制探討提供新的思路和方法。

結(jié)論

本研究成功建立了高效電穿孔介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染原代軟骨細(xì)胞的方法，實(shí)現(xiàn)了基因沉默效果并維持了較高的細(xì)胞存活率。通過(guò)優(yōu)化電穿孔參數(shù)、使用高效電轉(zhuǎn)緩沖液和鏈絲菌蛋白酶消化等方法，提高了轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。該方法具有廣泛的應(yīng)用前景，可以用于研究軟骨細(xì)胞相關(guān)基因的功能和調(diào)控機(jī)制，為軟骨疾病的治療和藥物研發(fā)提供有力支持。同時(shí)，該方法還可以擴(kuò)展到其他難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類(lèi)型，為生命科學(xué)研究和疾病機(jī)制探討提供新的思路和方法。