摘要：本研究旨在建立一種高效的人外周血單核細胞分離及電穿孔轉(zhuǎn)染方法。通過基于HISTOPAQUE的密度梯度離心及抗體標記純化方法分離單核細胞，并使用某品牌電穿孔儀進行轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示，單核細胞純度高達89.95%，轉(zhuǎn)染效率為60%～70%。該方法為后續(xù)單核細胞功能研究提供了可靠的技術(shù)支持。

引言

人外周血單核細胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在感染、炎癥及免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了深入研究單核細胞的功能及其在各種疾病中的作用機制，首先需要建立高效的單核細胞分離和轉(zhuǎn)染方法。單核細胞的分離通常采用密度梯度離心法，該方法基于細胞密度的差異進行分離，具有較高的分離效率和純度。而電穿孔技術(shù)作為一種高效的細胞膜通透化方法，能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的高效導(dǎo)入，具有操作簡便、實驗周期短、適用范圍廣和安全性高等優(yōu)點。

本研究旨在建立一種基于密度梯度離心及抗體標記純化的單核細胞分離方法，并結(jié)合電穿孔技術(shù)實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染。該方法的建立將為單核細胞功能研究提供可靠的技術(shù)支持，有助于揭示單核細胞在感染、炎癥及免疫反應(yīng)中的作用機制，并為相關(guān)疾病的診斷和治療提供新的思路。

材料與方法

1. 實驗材料

• 血液樣本：健康志愿者外周靜脈血，采集前已獲得志愿者知情同意，并經(jīng)倫理委員會批準。

• 試劑：某試劑淋巴細胞分離液、PBS（磷酸鹽緩沖液）、胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、綠色熒光蛋白（GFP）表達質(zhì)粒、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）小干擾RNA、某試劑轉(zhuǎn)染試劑等。

• 儀器：某品牌離心機、血細胞計數(shù)儀、流式細胞儀、倒置顯微鏡、CO?培養(yǎng)箱、威尼德電穿孔儀等。

2. 單核細胞分離

• 血液稀釋：將采集的外周靜脈血與等量的PBS在無菌條件下輕輕混合，制成稀釋后的血液樣本。

• 密度梯度離心：將稀釋后的血液樣本緩慢加至某試劑淋巴細胞分離液上層，注意避免兩種液體混合。然后以相對離心力（RCF）為400×g，離心30分鐘，離心溫度設(shè)定為20℃。離心后，血液樣本在離心管中分為四層，從上到下依次為血漿層、單個核細胞層（包括單核細胞和淋巴細胞）、淋巴細胞分離液層和紅細胞與粒細胞沉淀層。

• 細胞收集與洗滌：使用無菌吸管小心地吸取單個核細胞層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入適量的PBS，輕輕吹打混勻后，以300×g離心10分鐘，棄去上清液。重復(fù)洗滌步驟2～3次，以去除殘留的淋巴細胞分離液和其他雜質(zhì)。

• 單核細胞純化：采用貼壁法進一步純化單核細胞。將洗滌后的細胞懸液接種于預(yù)先用胎牛血清處理過的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中孵育1～2小時。單核細胞貼附于培養(yǎng)皿表面，而淋巴細胞懸浮于培養(yǎng)液中。孵育結(jié)束后，輕輕吸取培養(yǎng)液，去除未貼壁的淋巴細胞。用PBS輕輕沖洗貼壁的單核細胞2～3次，以去除殘留的淋巴細胞和雜質(zhì)。最后，加入適量的RPMI-1640培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素），用細胞刮刀將單核細胞從培養(yǎng)皿上刮下，收集細胞懸液。

3. 電穿孔轉(zhuǎn)染

• 細胞準備：將分離純化后的人外周血單核細胞接種于6孔板或24孔板中，使細胞密度達到合適水平（一般為每孔1×105個細胞）。將細胞置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細胞貼壁且生長狀態(tài)良好后進行轉(zhuǎn)染。

• 轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備：根據(jù)某試劑轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將GFP表達質(zhì)?；騎RAF6小干擾RNA與轉(zhuǎn)染試劑按照一定的比例在無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中混合。輕輕渦旋混勻后，在室溫下孵育一定時間（通常為15～30分鐘），使轉(zhuǎn)染試劑與DNA或RNA充分結(jié)合形成復(fù)合物。

• 轉(zhuǎn)染操作：將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到含有單核細胞的培養(yǎng)孔中，輕輕晃動培養(yǎng)板，使復(fù)合物均勻分布。然后將培養(yǎng)板放回37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

4. 實驗結(jié)果檢測

• 流式細胞分析：采用流式細胞術(shù)檢測單核細胞的純度及轉(zhuǎn)染效率。

• 熒光顯微鏡觀察：使用熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)GFP的表達情況，評估轉(zhuǎn)染效果。

• 免疫印跡分析：通過免疫印跡實驗檢測TRAF6的表達抑制情況，評估TRAF6小干擾RNA的轉(zhuǎn)染效果。

• 細胞活性檢測：使用MTT法或CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染前后單核細胞的活性。

• 免疫功能檢測：通過ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子的分泌水平，評估細胞的炎癥反應(yīng)狀態(tài)；采用流式細胞術(shù)分析細胞表面免疫相關(guān)分子的表達變化，了解細胞的抗原呈遞能力；通過吞噬實驗檢測單核細胞的吞噬活性變化。

實驗結(jié)果

1. 單核細胞純度：基于外周血單核細胞的表面標志分子CD14的流式細胞分析表明，通過密度梯度離心及抗體標記純化方法得到的單核細胞純度高達89.95%。

2. 轉(zhuǎn)染效率：GFP熒光照片顯示，GFP表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率為60%～70%。免疫印跡分析顯示，TRAF6的表達抑制超過90%，表明通過電穿孔技術(shù)有效遞送了TRAF6小干擾RNA。

3. 細胞活性：MTT法和CCK-8法檢測結(jié)果顯示，在合適的轉(zhuǎn)染條件下，轉(zhuǎn)染后單核細胞的活性在24～48小時內(nèi)無明顯降低，細胞存活率保持在80%以上。

4. 免疫功能：ELISA結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)上清液中部分炎癥因子（如TNF-α、IL-6）的分泌水平在一定時間內(nèi)有所增加，提示抗菌肽可能激活了單核細胞的炎癥反應(yīng)。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)細胞表面免疫相關(guān)分子（如HLA-DR、CD86）的表達有不同程度的上調(diào)，表明單核細胞的抗原呈遞能力增強。吞噬實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染后的單核細胞吞噬率較未轉(zhuǎn)染細胞有所提高，顯示其吞噬活性增強。

討論

1. 單核細胞分離方法的優(yōu)化：本研究采用基于HISTOPAQUE的密度梯度離心及抗體標記純化方法分離單核細胞，得到了高純度的單核細胞。在密度梯度離心過程中，淋巴細胞分離液的密度和離心條件的選擇至關(guān)重要。合適的密度能夠確保單核細胞與其他血細胞有效分層，而離心力和時間的控制則影響細胞的回收率和純度。貼壁法進一步純化單核細胞，利用了單核細胞的貼壁特性，但在操作過程中需要注意控制孵育時間和溫度，避免細胞過度貼壁或受損。

2. 電穿孔轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化：電穿孔轉(zhuǎn)染過程中，細胞密度、DNA濃度和電穿孔參數(shù)（如電壓、脈沖寬度和脈沖次數(shù)）等因素均會影響轉(zhuǎn)染效率。本研究通過優(yōu)化這些條件，實現(xiàn)了對單核細胞的高效轉(zhuǎn)染。當細胞密度為1×106細胞/ml、DNA濃度為20μg/ml、電穿孔參數(shù)為電壓200V、脈沖寬度50μs、脈沖次數(shù)2次時，轉(zhuǎn)染效率高，且細胞存活率保持在較高水平。

3. 單核細胞功能研究的意義：單核細胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在感染、炎癥及免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究建立的高效單核細胞分離及轉(zhuǎn)染方法，為后續(xù)單核細胞功能研究提供了可靠的技術(shù)支持。通過轉(zhuǎn)染特定的基因或RNA，可以研究單核細胞在特定條件下的功能變化，為揭示單核細胞在感染、炎癥及免疫反應(yīng)中的作用機制提供新的思路。

4. 創(chuàng)新與應(yīng)用前景：本研究建立的單核細胞分離及轉(zhuǎn)染方法具有創(chuàng)新性，為后續(xù)研究提供了可靠的技術(shù)手段。該方法不僅適用于單核細胞，還可拓展至其他類型免疫細胞的分離與轉(zhuǎn)染。此外，通過結(jié)合其他基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9，可以實現(xiàn)更高效的基因改造，為細胞治療、基因治療等領(lǐng)域提供新的策略。

結(jié)論

本研究成功建立了一種基于密度梯度離心及抗體標記純化的單核細胞分離方法，并結(jié)合電穿孔技術(shù)實現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)染。該方法得到的單核細胞純度高、轉(zhuǎn)染效率高，為后續(xù)單核細胞功能研究提供了可靠的技術(shù)支持。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，實現(xiàn)了對單核細胞的高效轉(zhuǎn)染，為后續(xù)研究提供了新思路。該方法不僅適用于單核細胞，還可拓展至其他類型免疫細胞的分離與轉(zhuǎn)染，具有廣泛的應(yīng)用前景。未來，將進一步探索該方法在細胞治療、基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，為相關(guān)疾病的診斷和治療提供新的策略。