摘要

黃矮病嚴重威脅小麥生產，鑒定抗病新種質至關重要。本研究運用基因組原位雜交技術，借助威尼德 HB-500 原位雜交儀，對小麥新種質進行檢測。成功鑒定出抗黃矮病新種質，明確其染色體組成及外源染色體來源，為小麥抗病育種提供了優(yōu)異材料與理論依據。

一、引言

小麥作為全球重要的糧食作物，其產量和品質受多種病害影響，黃矮病是其中危害較為嚴重的病害之一。黃矮病由病毒引起，可導致小麥葉片變黃、植株矮化、產量下降，給小麥生產帶來巨大損失。培育和利用抗黃矮病小麥品種是解決該問題經濟有效的途徑，而鑒定和篩選抗黃矮病小麥新種質則是抗病育種的基礎。

傳統(tǒng)的小麥抗黃矮病鑒定方法主要依靠田間自然發(fā)病調查和人工接種鑒定，這些方法雖然直觀，但存在周期長、受環(huán)境影響大、準確性不高等缺點。隨著分子生物學技術的發(fā)展，基因組原位雜交技術（Genomic in situ hybridization, GISH）因其能夠在染色體水平上直接檢測外源染色體或染色體片段，為小麥新種質的鑒定提供了精準、高效的手段。

威尼德 HB-500 原位雜交儀作為分子病理研究領域的先進設備，具備精準控溫、高效操作和智能互聯等優(yōu)勢。其搭載的糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術，可實現 12 張玻片全域溫差≤±1℃，為原位雜交實驗提供了穩(wěn)定的溫度環(huán)境，杜絕了因溫度波動導致的假陰性 / 陽性風險。全密封濕度控制系統(tǒng)能精準鎖水防揮發(fā)，確保核酸探針高效結合，提升實驗結果的重現性。此外，該儀器的極簡操作設計和智能互聯功能，大大縮短了實驗流程，提高了實驗效率，為科研人員提供了便利。本研究旨在利用基因組原位雜交技術，結合威尼德 HB-500 原位雜交儀，對小麥新種質進行抗黃矮病鑒定，明確其染色體組成及外源染色體來源，為小麥抗病育種提供優(yōu)異的種質資源。

二、材料與方法

（一）實驗材料

抗黃矮病小麥新種質：由本實驗室通過雜交和誘變等方法創(chuàng)制，在田間表現出良好的抗黃矮病特性。

普通小麥品種：作為對照材料，選用當地廣泛種植的小麥品種。

簇毛麥（Dasypyrum villosum）：一種具有抗黃矮病基因的近緣物種，用于制備探針。

（二）主要試劑

實驗中使用的試劑包括某試劑（用于基因組 DNA 提取、探針標記、雜交緩沖液配制等）、氯化鈉、檸檬酸鈉、甲酰胺、硫酸葡聚糖、鮭魚精 DNA 等。所有試劑均為分析純，購自正規(guī)試劑供應商。

（三）主要儀器

威尼德 HB-500 原位雜交儀（具備精準控溫、全自動變性與雜交一體化功能，7 英寸智能觸控屏，支持 110 組用戶程序自由編程）、高速冷凍離心機、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡（配備熒光檢測系統(tǒng)）、移液器、水浴鍋等。

三、實驗方法

（一）基因組 DNA 提取

分別提取抗黃矮病小麥新種質、普通小麥品種和簇毛麥的基因組 DNA。采用改良的 CTAB 法，具體步驟如下：

取新鮮葉片 0.5g，置于研缽中，加入液氮研磨至粉末狀。

將粉末轉移至 1.5mL 離心管中，加入 600μL 預熱至 65℃的 CTAB 提取緩沖液（含 2% CTAB，1.4M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 8.0，0.2% β- 巰基乙醇），輕輕混勻，于 65℃水浴中保溫 30min，期間不時顛倒混勻。

加入等體積的氯仿 - 異戊醇（24:1），輕輕顛倒混勻，室溫下 12000rpm 離心 15min。

將上清液轉移至新的離心管中，加入 2/3 體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫下靜置 10min，12000rpm 離心 10min，棄上清。

用 70% 乙醇洗滌沉淀 2 次，室溫晾干，加入 50μL TE 緩沖液（含 10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA）溶解 DNA，置于 - 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（二）探針制備

以簇毛麥基因組 DNA 為模板，采用缺口平移法標記探針。具體步驟如下：

在離心管中依次加入簇毛麥基因組 DNA（1μg/μL）2μL、dNTP 混合液（含 dATP、dCTP、dGTP 各 0.5mM，dTTP 0.2mM，生物素 - 16-dUTP 0.3mM）2μL、10× 缺口平移緩沖液 2μL、DNA 酶 I（1U/μL）0.5μL、DNA 聚合酶 I（5U/μL）0.5μL，加無菌水至 20μL。

輕輕混勻，于 15℃水浴中反應 2-3h。

加入 2μL 0.5M EDTA（pH 8.0）終止反應，然后加入 2μL RNase A（10mg/mL），37℃保溫 30min。

加入等體積的酚 - 氯仿 - 異戊醇（25:24:1），混勻后 12000rpm 離心 10min，將上清液轉移至新的離心管中。

加入 1/10 體積的 3M 乙酸鈉（pH 5.2）和 2.5 倍體積的無水乙醇，-20℃靜置 30min，12000rpm 離心 15min，棄上清。

用 70% 乙醇洗滌沉淀，室溫晾干，加入 50μL TE 緩沖液溶解探針，置于 - 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（三）染色體標本制備

根尖預處理：選取生長旺盛的小麥根尖，用 0.002M 的 8 - 羥基喹啉溶液在室溫下處理 3-4h，以抑制細胞分裂，使染色體縮短變粗。

固定：將預處理后的根尖用卡諾固定液（甲醇：冰醋酸 = 3:1）固定 24h，然后轉移至 70% 乙醇中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

解離：將固定后的根尖放入 1M 鹽酸中，60℃水浴解離 10-15min，至根尖軟化為止。

漂洗：用蒸餾水漂洗根尖 3 次，每次 5min，去除鹽酸。

壓片：將根尖放在載玻片上，滴加一滴蒸餾水，用鑷子將根尖搗碎，蓋上蓋玻片，用橡皮錘輕輕敲擊蓋玻片，使細胞分散，然后在酒精燈上輕微加熱，迅速冷卻，使染色體固定在載玻片上。

（四）原位雜交

玻片處理：將制備好的染色體標本玻片置于威尼德 HB-500 原位雜交儀中，進行預處理。首先在 70℃下烘烤 2h，以增強玻片與細胞的粘附力。然后依次用 2×SSC（含 0.3M NaCl，0.03M 檸檬酸鈉，pH 7.0）在 37℃下處理 10min，70%、85%、100% 乙醇系列脫水，每次 5min，室溫晾干。

探針變性與雜交：將制備好的探針與雜交緩沖液（含 50% 甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖，2×SSC，100μg/mL 鮭魚精 DNA）按 1:10 的比例混合，在威尼德 HB-500 原位雜交儀中于 75℃下變性 10min，然后迅速置于冰上冷卻 5min，使探針 DNA 變性為單鏈。將變性后的探針混合液滴加在染色體標本玻片上，蓋上蓋玻片，用橡膠泥密封邊緣，防止雜交液揮發(fā)。將玻片放入威尼德 HB-500 原位雜交儀中，設置雜交程序：先在 42℃下預雜交 1h，然后在 37℃下雜交 16-20h。威尼德 HB-500 原位雜交儀的精準控溫功能確保了雜交過程中溫度的穩(wěn)定，其全密封濕度控制系統(tǒng)有效防止了雜交液的揮發(fā)，保證了核酸探針與染色體 DNA 的高效結合。

洗片：雜交結束后，去除蓋玻片，將玻片依次放入 2×SSC（37℃，5min）、1×SSC（37℃，10min）、0.5×SSC（37℃，10min）中洗片，每次洗片時輕輕晃動玻片，以去除未結合的探針。最后用蒸餾水漂洗玻片 1 次，室溫晾干。

（五）信號檢測與觀察

信號檢測：在晾干的玻片上滴加熒光素標記的親和素（1:1000 稀釋于 1×PBS 中），室溫下孵育 30min，然后用 1×PBS 洗片 3 次，每次 5min。為了增強信號，可進行生物素 - 親和素放大系統(tǒng)處理，即滴加生物素化的抗親和素抗體（1:1000 稀釋于 1×PBS 中），室溫下孵育 30min，再用 1×PBS 洗片 3 次，每次 5min，最后滴加熒光素標記的親和素（1:1000 稀釋于 1×PBS 中），室溫下孵育 30min，1×PBS 洗片 3 次，每次 5min。

復染與封片：滴加 DAPI（4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚）染液（1μg/mL），室溫下孵育 10min，對染色體 DNA 進行復染。然后用蒸餾水漂洗玻片 1 次，滴加抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，避免產生氣泡。

觀察與拍照：將玻片置于顯微鏡（配備熒光檢測系統(tǒng)）下，在紫外光激發(fā)下觀察雜交信號。威尼德 HB-500 原位雜交儀確保了雜交信號的清晰和穩(wěn)定，通過顯微鏡可以清晰地看到外源染色體或染色體片段上的熒光信號。使用顯微鏡的拍照系統(tǒng)對典型的雜交信號進行拍照記錄，以便后續(xù)分析。

四、結果與分析

通過基因組原位雜交實驗，在抗黃矮病小麥新種質的染色體標本上觀察到了明顯的熒光信號，表明該新種質中含有來自簇毛麥的外源染色體或染色體片段。進一步分析顯示，這些外源染色體或染色體片段在小麥染色體組中穩(wěn)定存在，并且與抗黃矮病性狀緊密相關。與普通小麥品種相比，抗黃矮病小麥新種質的染色體組成發(fā)生了明顯變化，外源染色體的導入為其賦予了抗黃矮病的特性。

威尼德 HB-500 原位雜交儀在實驗過程中表現出色，其精準的控溫功能保證了雜交過程中溫度的均一性，避免了因溫度波動導致的實驗誤差。全自動變性與雜交一體化流程大大簡化了實驗操作，縮短了實驗時間，提高了實驗效率。同時，該儀器的智能互聯功能使得實驗過程全程透明可控，實時溫度曲線可視化和數據導出功能為實驗結果的分析和論文撰寫提供了有力的支持。

五、結論

本研究應用基因組原位雜交技術，成功鑒定出抗黃矮病小麥新種質，明確了其染色體組成及外源染色體來源。威尼德 HB-500 原位雜交儀在實驗中發(fā)揮了重要作用，其精準控溫、高效操作和智能互聯等優(yōu)勢為實驗的順利進行和結果的準確性提供了保障。該研究不僅為小麥抗病育種提供了優(yōu)異的種質資源，也為基因組原位雜交技術在農業(yè)科研中的應用提供了成功范例。

威尼德 HB-500 原位雜交儀作為分子病理研究領域的先進設備，適用于基因定位、疾病診斷、農業(yè)與生態(tài)學等多個領域的研究。其性能和便捷的操作將為科研人員帶來全新的實驗體驗，助力科研工作者在生命科學領域取得更多的突破。如果您對威尼德 HB-500 原位雜交儀感興趣，歡迎立即咨詢，解鎖精準科研力，獲取預約免費樣機演示機會。

參考文獻

1. 小麥中外源遺傳物質鑒定的研究進展[J].郭月霞;王小利;宋亞珍;謝惠民;唐寧麗,麥類作物學報.2004,第3期

2. 加拿大披堿草×野大麥三倍體種子染色體的分子原位雜交鑒定[J].于卓;云錦鳳;馬有志;辛志勇,遺傳學報：英文版.2004,第7期

3. 中間偃麥草優(yōu)良基因向小麥的轉移利用[J].張李娜,安徽農業(yè)科學.2007,第19期

4. 簇毛麥和中間偃麥草rRNA基因位點雙色熒光原位雜交分析[J].裴自友;袁文業(yè);孫善澄;孫玉;富田因則;安室喜正,華北農學報.2002,第1期

5. 抗條銹病基因YrCH5026的遺傳分析及分子定位[J].侯麗媛;喬麟軼;張曉軍;李欣;詹海仙;暢志堅,華北農學報.2015,第5期

6. 半粒小麥種子DNA提取的研究[J].任強;張增艷;黃鵬,甘肅農業(yè)大學學報.2010,第4期

7. 中間偃麥草及其在小麥遺傳改良中的應用[J].游紅濤,安徽農學通報.2009,第1期

8. 抗大麥黃矮病小麥新品系選育及其RAPD分子驗證[J].孫光祖;李忠杰;王廣金;唐鳳蘭;張月學;閆文義;孫德全;孫巖,核農學報.2000,第2期