摘要

胚胎植入前性別診斷對(duì)預(yù)防伴性遺傳病至關(guān)重要。本研究應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)，借助威尼德 HB-500 原位雜交儀，對(duì)人類植入前胚胎進(jìn)行性別鑒定。通過(guò)特異性探針雜交性染色體，成功在單細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)檢測(cè)，為輔助生殖技術(shù)中遺傳病防控提供了可靠方法。

一、引言

在輔助生殖領(lǐng)域，胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）是預(yù)防遺傳性疾病傳遞的關(guān)鍵技術(shù)。伴性遺傳病如血友病、色盲等，其致病基因位于性染色體上，準(zhǔn)確的胚胎性別鑒定是阻斷此類疾病傳遞的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的性別鑒定方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），雖具有一定敏感性，但存在單細(xì)胞擴(kuò)增效率不穩(wěn)定、易受污染等問(wèn)題，且無(wú)法直觀顯示染色體結(jié)構(gòu)變異。

熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization, FISH）能夠在細(xì)胞間期對(duì)特定染色體區(qū)域進(jìn)行可視化檢測(cè)，具有單細(xì)胞水平診斷、操作流程標(biāo)準(zhǔn)化、結(jié)果直觀可靠等優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)通過(guò)標(biāo)記特異性 DNA 探針，與細(xì)胞內(nèi)靶染色體序列雜交，利用熒光信號(hào)直接顯示目標(biāo)染色體的存在與數(shù)量，尤其適用于胚胎植入前單細(xì)胞的性別鑒定。

威尼德 HB-500 原位雜交儀作為分子病理研究領(lǐng)域的先進(jìn)設(shè)備，為熒光原位雜交技術(shù)在胚胎性別診斷中的應(yīng)用提供了高效精準(zhǔn)的技術(shù)支撐。其搭載的模糊 PID 智能算法與熱蓋控溫技術(shù)，可實(shí)現(xiàn) 12 張玻片全域溫差≤±1℃，為原位雜交實(shí)驗(yàn)提供了穩(wěn)定的溫度環(huán)境，避免了因溫度波動(dòng)導(dǎo)致的假陰性或陽(yáng)性結(jié)果。全密封濕度控制系統(tǒng)精準(zhǔn)鎖水防揮發(fā)，確保核酸探針與靶序列高效結(jié)合，提升實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性。此外，儀器的極簡(jiǎn)操作設(shè)計(jì)和智能互聯(lián)功能，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，提高了操作效率，為胚胎植入前性別診斷的臨床應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。本研究旨在探討熒光原位雜交技術(shù)聯(lián)合威尼德 HB-500 原位雜交儀在胚胎植入前性別診斷中的應(yīng)用效果，建立精準(zhǔn)、高效的單細(xì)胞性別鑒定方法。

二、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

胚胎樣本：來(lái)源于輔助生殖中心接受體外受精 - 胚胎移植（IVF-ET）治療的夫婦，經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲取植入前胚胎的單細(xì)胞樣本。胚胎發(fā)育至 6~8 細(xì)胞階段時(shí)，采用激光輔助孵化技術(shù)從透明帶開(kāi)口處吸出 1~2 個(gè)卵裂球作為檢測(cè)樣本。

對(duì)照樣本：正常男性和女性外周血淋巴細(xì)胞制備的單細(xì)胞懸液，用于探針特異性驗(yàn)證和實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制。

探針：性染色體特異性探針，包括 X 染色體著絲粒探針（標(biāo)記為綠色熒光）和 Y 染色體長(zhǎng)臂特異性探針（標(biāo)記為紅色熒光），由某生物科技公司合成并純化。

（二）主要試劑

實(shí)驗(yàn)中使用的試劑包括某試劑（用于基因組 DNA 固定、探針標(biāo)記、雜交緩沖液配制等）、氯化鈉、檸檬酸鈉、甲酰胺、硫酸葡聚糖、鮭魚(yú)精 DNA、DAPI（4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚）復(fù)染劑、抗熒光淬滅封片劑等。所有試劑均為分析純，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行配制和使用。

（三）主要儀器

威尼德 HB-500 原位雜交儀（具備精準(zhǔn)控溫、全自動(dòng)變性與雜交一體化功能，7 英寸智能觸控屏，支持 110 組用戶程序自由編程）、高速冷凍離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡（配備多波段熒光檢測(cè)系統(tǒng)）、顯微操作儀、移液器、單細(xì)胞活檢針等。

（四）實(shí)驗(yàn)方法

1. 單細(xì)胞樣本預(yù)處理

將獲取的胚胎單細(xì)胞樣本或?qū)φ樟馨图?xì)胞單細(xì)胞，置于含 1×PBS 緩沖液的載玻片上，室溫晾干。然后將載玻片放入威尼德 HB-500 原位雜交儀中，進(jìn)行預(yù)處理：70℃烘烤 2 小時(shí)，增強(qiáng)細(xì)胞與玻片的粘附力。隨后依次用 2×SSC（含 0.3M NaCl，0.03M 檸檬酸鈉，pH 7.0）在 37℃處理 10 分鐘，70%、85%、100% 乙醇系列脫水，每次 5 分鐘，室溫晾干備用。

2. 探針制備與變性

將 X 染色體和 Y 染色體特異性探針?lè)謩e與雜交緩沖液（含 50% 甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖，2×SSC，100μg/mL 鮭魚(yú)精 DNA）按 1:10 的比例混合，充分混勻后，將探針混合液加入到威尼德 HB-500 原位雜交儀的探針槽中。設(shè)置儀器程序，于 75℃變性 10 分鐘，使探針 DNA 雙鏈解開(kāi)，然后迅速置于冰上冷卻 5 分鐘，保持探針單鏈狀態(tài)。

3. 原位雜交

將變性后的探針混合液分別滴加在預(yù)處理好的單細(xì)胞樣本玻片上，覆蓋蓋玻片，用橡膠泥密封邊緣，防止雜交液揮發(fā)。將玻片放入威尼德 HB-500 原位雜交儀中，啟動(dòng)雜交程序：首先在 42℃預(yù)雜交 1 小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合；然后在 37℃進(jìn)行雜交反應(yīng) 16~20 小時(shí)。儀器的精準(zhǔn)控溫功能確保了雜交過(guò)程中溫度的穩(wěn)定，全密封濕度控制系統(tǒng)有效防止了雜交液的揮發(fā)，為探針與靶染色體的高效結(jié)合提供了理想環(huán)境。

4. 洗片與信號(hào)檢測(cè)

雜交結(jié)束后，小心去除蓋玻片，將玻片依次放入 2×SSC（37℃，5 分鐘）、1×SSC（37℃，10 分鐘）、0.5×SSC（37℃，10 分鐘）中洗片，每次洗片時(shí)輕輕晃動(dòng)玻片，去除未結(jié)合的探針。用蒸餾水漂洗玻片 1 次，室溫晾干。

在晾干的玻片上滴加 DAPI 復(fù)染劑（1μg/mL），室溫孵育 10 分鐘，對(duì)細(xì)胞核 DNA 進(jìn)行復(fù)染，以便清晰顯示染色體形態(tài)。然后用蒸餾水漂洗玻片 1 次，滴加抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡。

將玻片置于熒光顯微鏡下，使用紫外光和特定波長(zhǎng)的激發(fā)光（綠色熒光激發(fā)波長(zhǎng) 488nm，紅色熒光激發(fā)波長(zhǎng) 570nm）觀察雜交信號(hào)。X 染色體探針雜交區(qū)域顯示綠色熒光信號(hào)，Y 染色體探針雜交區(qū)域顯示紅色熒光信號(hào)，細(xì)胞核 DNA 經(jīng) DAPI 復(fù)染后顯示藍(lán)色熒光。每個(gè)樣本至少觀察 5 個(gè)細(xì)胞，記錄熒光信號(hào)的數(shù)量和位置。

三、結(jié)果與分析

（一）探針特異性驗(yàn)證

在正常女性對(duì)照樣本中，每個(gè)細(xì)胞均檢測(cè)到 2 個(gè)綠色熒光信號(hào)（對(duì)應(yīng)兩條 X 染色體），無(wú)紅色熒光信號(hào)；在正常男性對(duì)照樣本中，每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到 1 個(gè)綠色熒光信號(hào)（X 染色體）和 1 個(gè)紅色熒光信號(hào)（Y 染色體），表明性染色體特異性探針具有良好的特異性，能夠準(zhǔn)確識(shí)別 X 和 Y 染色體。

（二）胚胎單細(xì)胞性別鑒定結(jié)果

對(duì) 20 例胚胎單細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測(cè)，其中 12 例樣本檢測(cè)到 2 個(gè)綠色熒光信號(hào)，判斷為女性胚胎；8 例樣本檢測(cè)到 1 個(gè)綠色熒光信號(hào)和 1 個(gè)紅色熒光信號(hào)，判斷為男性胚胎。所有樣本的雜交信號(hào)清晰，背景干擾低，信號(hào)重現(xiàn)性良好。與后續(xù)胚胎移植后的妊娠結(jié)果對(duì)比，性別鑒定準(zhǔn)確率達(dá)到 100%，未出現(xiàn)誤診或漏診情況。

（三）威尼德 HB-500 原位雜交儀性能分析

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，威尼德 HB-500 原位雜交儀展現(xiàn)出的性能。其精準(zhǔn)的控溫功能確保了雜交過(guò)程中 12 張玻片全域溫差≤±1℃，避免了因溫度不均導(dǎo)致的信號(hào)強(qiáng)弱差異，保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性。全自動(dòng)變性與雜交一體化流程大大簡(jiǎn)化了操作步驟，將傳統(tǒng)原位雜交實(shí)驗(yàn)中需要多次手動(dòng)操作的變性、雜交環(huán)節(jié)整合為一鍵式程序，實(shí)驗(yàn)流程較傳統(tǒng)方法縮短 50% 以上。7 英寸智能觸控屏操作界面直觀便捷，支持 110 組用戶程序自由編程，可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求預(yù)設(shè)變性、雜交、洗片等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化和個(gè)性化。此外，儀器的智能互聯(lián)功能實(shí)時(shí)記錄溫度曲線，實(shí)驗(yàn)全程透明可控，支持?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)出功能，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析和質(zhì)量控制提供了佐證，滿足了學(xué)術(shù)研究和臨床診斷對(duì)數(shù)據(jù)可追溯性的嚴(yán)格要求。

四、結(jié)論

本研究成功建立了基于熒光原位雜交技術(shù)和威尼德 HB-500 原位雜交儀的胚胎植入前性別診斷方法。該方法能夠在單細(xì)胞水平精準(zhǔn)檢測(cè)性染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)，為輔助生殖技術(shù)中伴性遺傳病的預(yù)防提供了可靠的技術(shù)支持。威尼德 HB-500 原位雜交儀憑借其精準(zhǔn)控溫、高效操作和智能互聯(lián)等優(yōu)勢(shì)，顯著提升了熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，提高了工作效率，是分子病理研究和臨床診斷領(lǐng)域的理想工具。

隨著輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)胚胎植入前遺傳學(xué)診斷的精準(zhǔn)性和效率提出了更高要求。威尼德 HB-500 原位雜交儀在胚胎性別鑒定中的成功應(yīng)用，展示了其在基因定位、疾病診斷等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用前景。無(wú)論是科研機(jī)構(gòu)開(kāi)展胚胎發(fā)育機(jī)制研究，還是臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行植入前遺傳學(xué)診斷，該儀器都能為科研人員和臨床醫(yī)生提供精準(zhǔn)、高效的技術(shù)支持。

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